張增祥, 王 偉 郝建華 牛 瑞 孫 謐

（1. 中國水產(chǎn)科學研究院 黃海水產(chǎn)研究所海洋產(chǎn)物資源與酶工程實驗室, 山東 青島 266071; 2. 上海海洋大學 食品學院, 上海 201306）

產(chǎn)過氧化氫酶菌株CE-1的篩選與鑒定

張增祥1,2, 王 偉1, 郝建華1, 牛 瑞1, 孫 謐1

（1. 中國水產(chǎn)科學研究院 黃海水產(chǎn)研究所海洋產(chǎn)物資源與酶工程實驗室, 山東 青島 266071; 2. 上海海洋大學 食品學院, 上海 201306）

經(jīng)過含 H2O2的平板初篩和搖瓶發(fā)酵復篩, 從保存的水樣中篩選到一株過氧化氫酶高產(chǎn)菌株CE-1,其所產(chǎn)過氧化氫酶活性和比活分別為1 356.2 U/mL和3 401 U/mg。菌株CE-1為革蘭氏陰性桿狀細菌,根據(jù)其形態(tài)特征、16S rRNA基因序列系統(tǒng)進化樹分析和生理生化特性, 以及屬內(nèi)不同種間性狀差異等因素的綜合分析, 將菌株CE-1鑒定為氣單胞屬（Aeromonas）細菌。

過氧化氫酶;分離;鑒定;系統(tǒng)發(fā)育學分析

過氧化氫酶（hydroperoxidase, catalase, 過氧化氫氧化還原酶, EC1.11.1.6）是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶, 能夠高效催化過氧化氫分解, 具有清除生物體內(nèi)自由基, 保護細胞免受損害等作用[1]。由于其高效催化的能力, 近年來廣泛用于食品、醫(yī)學診斷以及紡織、造紙等工業(yè)領域[2]。近幾十年來過氧化氫酶一直是國內(nèi)外研究的熱點[3], 而目前國內(nèi)對微生物過氧化氫酶的研究主要集中在其發(fā)酵生產(chǎn)、酶學性質和應用方面[2,4～11]。本實驗是在對實驗室所保存的水樣進行廣泛篩選的基礎上, 篩選分離出一株高過氧化氫酶活性的菌株并對其進行了分類鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育學分析, 為下一步的研究奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

基礎培養(yǎng)基: 蛋白胨 1%, 牛肉膏 0.3%, NaCl 0.5%, pH 7.0～7.5。

1.2 主要試劑和儀器

考馬斯亮藍G250, USB公司; ExTaq DNA聚合酶,大連寶生物工程有限公司; 其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

Nikon 50i型顯微鏡: 日本 Nikon公司; Sonics VCF1500超聲破碎儀: 美國 Sonics公司; 日立高速冷凍離心機: 日本HITACHI公司; 752N紫外可見光分光光度計: 上海精密科學儀器有限公司; PCR儀:德國Whatman Biometra公司。

1.3 水樣

所用水樣為中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所海洋產(chǎn)物資源與酶工程實驗室保存。

1.4 產(chǎn)過氧化氫酶菌株的篩選和分離

1.4.1 初篩

含 2%（w/v）瓊脂的基礎培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50℃加入H2O2, 使終濃度達1 mmol/L。倒平板。以200 μL樣品涂布, 25 ℃培養(yǎng)24 h。生長出的單菌落劃斜面保藏。

1.4.2 復篩

初篩獲得的菌株從斜面接入含50 mL基礎培養(yǎng)基的250 mL搖瓶。200 r/min, 25 ℃條件下培養(yǎng)24 h。離心收菌體, 以pH 7, 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液重懸菌體并在冰浴中超聲破碎。離心后取上清測過氧化氫酶活性和蛋白含量。

1.5 酶活力和蛋白含量的測定

過氧化氫酶酶活力采用紫外分光光度法[12]。測無菌體的發(fā)酵液和破碎后上清的活性。酶活性以H2O2在 240 nm處分解速率進行計算。反應體系為50 mmol/L pH 7磷酸鹽的鈉鹽緩沖液, H2O2濃度20 mmol/L。取一定量樣品加到1 mL磷酸鹽緩沖液中,在比色杯中混勻, 再迅速加入以磷酸鹽緩沖液配制的40 mmol/L的H2O21 mL起始反應。以時間（x）對吸光度（y）作圖, 直線回歸計算出斜率即反應速率。將25 ℃每分鐘消耗 1μmol H2O2的酶量定義為一個活力單位。

蛋白含量測定采用Bradford法[13]。過氧化氫酶比活力計算公式:

1.6 形態(tài)特征的觀察

將經(jīng)過篩選所確定的菌株, 平板劃線, 25 ℃培養(yǎng)24 h, 觀察菌落形態(tài)并進行革蘭氏染色[14]。

1.7 16S rDNA的PCR擴增和測序以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

提取細菌總 DNA, 以 16S rDNA通用引物:27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3’）和 1492r（5’-CGGCTACCTTGTTACGAC-3’）擴增, PCR 反應體系和擴增程序參考文獻[15]。

PCR產(chǎn)物送上海生工測序。將所測定菌株的16S rDNA序列通過BLAST檢索已有序列, 進行相似性比較分析, 下載與實驗菌株親緣關系較近的序列, 用Clustal X軟件進行多序列比對, 采用MEGA4軟件的鄰接法（neighbor-joining method）進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.8 產(chǎn)過氧化氫酶菌株的生理生化鑒定

根據(jù)菌株培養(yǎng)特征,細胞形態(tài),革蘭氏染色和氧化酶反應選擇法國梅里埃公司API 20E試劑條,測定菌株生理生化反應,并參照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

2.1.1 初篩結果

用含高濃度過氧化氫的平板進行初篩, 25 ℃培養(yǎng)24 h后初篩平板上出現(xiàn)肉眼可見的菌落, 說明在水樣中存在過氧化氫酶活性較高的菌株。將生長出的菌落分別劃線分離, 共篩選到 14株高活性菌株,斜面培養(yǎng)基4 ℃保藏。

2.1.2 復篩結果

上述14株菌株經(jīng)過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后, 測定酶活性和蛋白質含量。結果顯示, 比活力大于1 200 U/mg的菌株僅有7株。這7株菌分別經(jīng)8次搖瓶傳代培養(yǎng)后, 僅有1株的產(chǎn)酶穩(wěn)定性較好, 酶活力和比活分別達到1 356.2 U/mL和3 401 U/mg, 是第一代菌株酶活性的90.2%, 而其他菌株均低于80%。故確定該菌為下一步的實驗菌株, 并命名為CE-1。

2.2 菌株鑒定結果

2.2.1 形態(tài)特征

菌株 CE-1在基礎培養(yǎng)基平板上25 ℃培養(yǎng)24 h,菌落為乳白色、微凸、易挑取, 表面光滑濕潤、邊緣整齊。菌體大小約為 0.2～0.5 μm×1.0～4.4 μm; 革蘭氏染色陰性; 呈桿狀, 圓端, 單個或短鏈狀排列。

2.2.2 菌株CE-1的16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

產(chǎn)過氧化氫酶菌株CE-1的16S rDNA PCR產(chǎn)物測序, 獲得長度為1384 bp的序列（登錄號GQ161962）。與 GenBank已有序列進行比較, 菌株 CE-1的 16S rDNA與豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）的序列（登錄號X74674）完全一致。用MEGA4軟件的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）, 可見CE-1是氣單胞屬細菌。

2.2.3 生理生化特征

將菌株CE-1和系統(tǒng)發(fā)生學相關的氣單胞菌屬菌株的特性進行比較, 可見存在明顯差別（表1）。

16S rDNA序列分析一般應用于區(qū)分和確定屬之間的關系, 通常不能以此作為定種的依據(jù), 而且在相似度達到 97%以及以上時會大大降低鑒定的可靠性[16,17]。而在氣單胞菌屬中各菌種的16S rDNA相似度都很高, 根據(jù)16S rDNA相似性無法確認CE-1是豚鼠氣單胞菌。菌株CE-1的生理生化性狀同16S rDNA相似菌株（包括豚鼠氣單胞菌）的性狀的比較中,產(chǎn)半乳糖苷酶、產(chǎn)精氨酸雙水解酶、產(chǎn)明膠酶、使山梨醇氧化/發(fā)酵、產(chǎn)細胞色素氧化酶、使葡萄糖氧化和使苦杏仁苷氧化/發(fā)酵等指標中存在很大的差異,這些生化指標的差別會影響將CE-1鑒定到種的準確性, 因此將其鑒定為氣單胞菌屬細菌。

3 結論

采用添加 H2O2的平板培養(yǎng)基, 從實驗室所保存的水樣中篩選到具有高效產(chǎn)生過氧化氫酶能力的菌株CE-1, 并用API 20E試劑條和16S rDNA序列進行綜合分析, 將這株細菌鑒定為氣單胞屬細菌。菌株CE-1產(chǎn)酶穩(wěn)定性良好, 經(jīng)過搖瓶發(fā)酵測得酶活力和相對酶活分別達到1 356.2 U/mL和3 401 U/mg, 這與國內(nèi)外報道的產(chǎn)過氧化氫酶菌株相比有一定的優(yōu)勢（表 2）。本實驗再次證明 H2O2平板法篩選高活性過氧化氫酶菌株是方便有效的[12]。而且在目前產(chǎn)過氧化氫酶菌株的大量研究中, 尚未見氣單胞菌屬細菌高產(chǎn)過氧化氫酶的報道, 該菌株的成功分離提供了新的產(chǎn)過氧化氫酶微生物資源, 同時也豐富了對氣單胞菌的認識。

圖1 菌株CE-1的系統(tǒng)發(fā)育學地位Fig. 1 Phylogenetic Status of strain CE-1

表1 菌株CE-1和系統(tǒng)發(fā)生學相關的氣單胞菌屬菌株的生理生化特征比較Tab. 1 Comparison of physiological characteristics of strain CE-1 with related Aeromonas species

表2 一些菌株產(chǎn)過氧化氫酶水平比較Tab. 2 Comparison of catalase production by different strains quantitated by activity in medium

目前從Aspergillus niger分離純化得到的過氧化氫酶已經(jīng)進行了工業(yè)生產(chǎn)和商業(yè)應用, 其所產(chǎn)過氧化氫酶酶活力為 4000 U/mg[23], 本實驗所篩選得到的菌株CE-1所產(chǎn)過氧化氫酶的比活可達3 401 U/mg,對比可見CE-1具有較大的開發(fā)應用潛力, 是一株值得深入研究的菌株。下步的工作將對該菌株誘變育種以及最佳培養(yǎng)條件進行優(yōu)化, 同時, 本實驗的開展為后續(xù)酶的分離純化以及性質研究等提供了必要的基礎, 也對下一步的研究具有重要的指導意義。

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Received: Dec., 10, 2009

Key words:Catalase; Isolation; Identification; Phylogenetic analysis

Abstract:Catalase-producing strain CE-1 was isolated from water samples using H2O2-containing plate screening and activity assay of the shake flask culture method. The values of the activity and specific activity were 1356.2 U/mL and 3401U/mg, respectively. CE-1 was Gram negative and rod in shape. Based on the comprehensive analysis of morphological and physiological characteristics, the 16S rDNA phylogenetic tree, and the differences among different species of Aeromonas, strain CE-1 was identified to be Aeromonas.

（本文編輯:康亦兼）

Isolation and identification of catalase-producing strain CE-1

ZHANG Zeng-xiang1,2, WANG Wei1, HAO Jian-hua1, NIU Rui1, SUN Mi1
（1. Laboratory of Marine Products and Enzyme Engineering, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2. College of Food Science & Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China）

Q554+.6

A

1000-3096（2010）11-0054-05

2009-12-10;

2010-04-20

國家高技術研究發(fā)展（863）計劃項目（2007AA091602）; 國家自然科學基金項目（41006119）; 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所

基本科研業(yè)務費專項資金項目（2010-gy-01）

張增祥（1984-）, 男, 山東安丘人, 碩士研究生, 主要從事微生物過氧化氫酶研究, 電話: 0532-85833961; E-mail: zhangzengxiang@yeah.net;孫謐, 通信作者, 電話: 0532-85819525, E-mail: sunmi@ysfri.ac.cn