徐建超 章世元 全麗萍 謝月華 韓莉娜 侯文博

中國是生豬資源大國，產(chǎn)品肝素鈉原料資源豐富，是世界上肝素鈉主要出口國之一。目前我國主要以豬小腸粘膜為原料，提取的肝素鈉（任紅媛等，2007）抗凝活性高，在國際市場上頗受歡迎。肝素在組織內(nèi)和其它粘多糖一起以共價鍵的形式與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，需進行水解使其解離下來（江燕等，2001），故該廢水是一種高鹽、高氮的高濃度有機廢水，含豐富的腸膜蛋白，目前鹽解法廠家可獲得腸膜蛋白粉，酶解法中的腸膜蛋白則隨污水排放。據(jù)侍愛秋（2002）的報道推算，我國肝素加工廢水年排放量約64.2萬噸，粗略估計含粗蛋白量高達4 333.5 t，數(shù)量可觀。目前，許多企業(yè)以優(yōu)質(zhì)蛋白為原料，應(yīng)用現(xiàn)代生物工程技術(shù)開發(fā)小肽系列產(chǎn)品，使其富含動物生長必需的有生命活動調(diào)節(jié)功能的生物活性肽和易吸收利用的營養(yǎng)性短肽。蛋白經(jīng)過酶解或發(fā)酵處理后具有易于吸收、低抗原等特點，并能加快機體蛋白合成，提高機體免疫力，刺激消化道發(fā)育，增進動物食欲，促進礦物元素吸收，加速脂肪代謝等功能，從而提高生長速度，改善飼料利用率，是新一代綠色、高效、安全的營養(yǎng)性飼料添加劑。本試驗利用各種蛋白酶水解肝素加工廢水中的腸膜肽，確定最佳酶解條件，以期為該廢水金屬蛋白肽鹽合成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 原料

肝素加工廢水是鹽解法提取肝素鈉工藝廢水，撈取腸膜蛋白后其主要成分分析見表1。

表1 肝素加工廢水主要成分分析

1.1.2 試劑

水解蛋白酶：活力2.4 AU-A/g；風味蛋白酶：活力1 000 LAPU/g；復(fù)合蛋白酶：活力1.5AU-NH/g。3種酶及酶活均來自諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

pHB-5酸度計（上海偉業(yè)儀器廠生產(chǎn)）、4℃冷凍離心機（上海浦東天本離心機械有限公司生產(chǎn)）、SHT型精密數(shù)顯磁力攪拌電熱套（山東省菏澤市祥龍電子科技有限公司生產(chǎn)）。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶解工藝（陸利霞等，2008）

量取一定量肝素廢水，用磷酸鹽緩沖液調(diào)至不同pH值，準確加入不同量的各種酶（注：相對于底物粗蛋白含量，下同），在不同溫度下，反應(yīng)一定時間用酶解液滅酶（100℃，3 min），然后5 000 r/min離心 15 min，取上清液備用測定水解度。

1.2.2 總氮的測定

采用凱氏定氮法GB11891——89。

1.2.3 氨基氮的測定（郭艷，2008；陳貴堂等，2008）

采用甲醛滴定法GB/T5009.39——2003。

1.2.4 水解度的計算（張全才，2007；陳杰等，2007）

水解度(%)=(氨態(tài)氮/總氮)×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

Excel建立數(shù)據(jù)庫,SPSS17.0統(tǒng)計軟件的ANOVA法進行方差分析,S-N-K法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解酶的確定

從肝素加工廢水中提取易被動物吸收的腸膜肽，首先要確定水解酶。催化蛋白質(zhì)水解的酶種類很多，主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶等。內(nèi)肽酶將蛋白質(zhì)分子內(nèi)部切斷形成多肽。外肽酶從蛋白質(zhì)分子的游離氨基或羧基的末端逐個將肽鍵水解，而游離出氨基酸。工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用的蛋白酶主要是內(nèi)肽酶，如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶等。水解蛋白時，內(nèi)肽酶和外肽酶復(fù)合作用才能得到高水解度的復(fù)合氨基酸液。外肽酶還能賦予產(chǎn)生的肽和氨基酸更多的香味和更飽滿的風味。

本試驗采用水解蛋白酶、風味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶及水解-風味復(fù)合酶。其中風味蛋白酶是外切酶，水解蛋白酶是內(nèi)切酶，復(fù)合蛋白酶由內(nèi)切酶和外切酶復(fù)合。根據(jù)各酶適用的水解條件為：pH值7，溫度50 ℃，總酶量 2%，測定時間 1、2、3、4、5 h。采取 3 個平行試驗，對時間因素選取5個水平，考察4種蛋白酶水解肝素廢水測得的水解度，結(jié)果見表2。

表2 各種蛋白酶水解肝素廢水測得水解度（%）

由表2可知,以肝素加工廢水為底物，相比之下用風味-水解2：1復(fù)合酶水解效果最好。3 h時蛋白水解度最高,為7.49%。所以選擇風味-水解復(fù)合酶做進一步研究。

2.2 風味-水解復(fù)合酶水解條件的初步確定

影響蛋白酶水解效果的因素有很多，如水解溫度、pH值、水解時間、料液比、加酶量等。利用單因素試驗法設(shè)計5組試驗，分別考察風味-水解復(fù)合酶水解的最佳作用條件范圍，對該酶水解條件進行初步確定。

2.2.1 最適反應(yīng)時間的確定

采取3個平行試驗，pH值為7.0，溫度50℃，加酶量2.0%，風味蛋白酶、水解蛋白酶比例為2：1，時間分別調(diào)至 1、2、3、4、5、6、7、8、9 h，試驗結(jié)果如圖1 所示。

一般來說，同樣的加酶量，水解時間越長水解度越高，到了一定的時間后上升趨勢會減慢。由圖1可見，反應(yīng)時間對水解度影響較明顯。在前5 h里隨著反應(yīng)時間的增加，蛋白水解度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，以3 h時水解度最大。5 h后隨著反應(yīng)時間的延長，水解度逐漸上升?？赡苁莾煞N酶對該底物的最佳水解時間差距較大?？紤]能耗因素，故確定最適反應(yīng)時間為3 h進行后續(xù)試驗。

2.2.2 最適總酶量的確定

采取3個平行試驗，水解pH值為7.0、溫度50℃、反應(yīng)時間為3 h、風味蛋白酶、水解蛋白酶比例為2：1，改變反應(yīng)體系中的酶添加量（1%、2%、3%、4%），考察酶添加量與腸膜蛋白提取率的關(guān)系，試驗結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，當風味蛋白酶與水解蛋白酶以2：1比例復(fù)合時，總濃度在2%其水解度最大，所以確定兩種酶總濃度最適為2%。

2.2.3 風味蛋白酶與水解蛋白酶最適比的確定

采取3個平行試驗，水解pH值為7.0，溫度50℃，反應(yīng)時間為3 h，加酶總量為2%，風味、水解蛋白酶比例分別為 1： 1、2： 1、3： 1、4： 1，試驗結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，酶總量為2%時水解度隨風味蛋白酶與水解蛋白酶復(fù)合比例的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，兩酶以2：1復(fù)合時腸膜蛋白水解度最大，但總體上兩酶的比例對蛋白水解度影響不大。故確定風味蛋白酶與水解蛋白酶最適比為2：1。

2.2.4 最適酶解溫度的確定

采取3個平行試驗，水解pH值為7.0，反應(yīng)時間為3 h，加酶總量為2%，風味、水解蛋白酶比例為2：1，酶解溫度分別設(shè)為40、50、60、70℃，試驗結(jié)果如圖4所示。

酶對溫度也比較敏感，有其最適的反應(yīng)溫度范圍。由圖4可知，隨著溫度的增加，水解度總體呈上升趨勢，40℃至50℃上升較明顯，50℃之后比較平緩，考慮經(jīng)濟因素，確定最適反應(yīng)溫度為50℃。

2.2.5 最適pH值的確定

采取3個平行試驗，反應(yīng)時間為3 h，加酶總量為2%，風味、水解蛋白酶比例為2：1，酶解溫度為50 ℃，pH 值設(shè)為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，試驗中每隔半小時對pH值進行一次調(diào)節(jié),試驗結(jié)果如圖5所示。

酶作為一種具有生物活性的蛋白質(zhì)，環(huán)境pH值會影響酶分子的構(gòu)象和酶分子及底物的解離狀態(tài)，從而影響酶的活性和酶促反應(yīng)速度。由圖5可知，pH值對該酶水解效果影響較明顯。隨著pH值的增加，水解度呈下降的趨勢，在pH值為4.0到7.0之間較平緩，而7.0之后下降幅度較大。所以選擇pH值為4.0、5.0、6.0 進行正交試驗。

2.3 風味-水解復(fù)合酶酶解正交試驗

依據(jù)單因素試驗初步確定的酶解條件，選擇pH值，酶總濃度，風味、水解蛋白酶比例，反應(yīng)時間，反應(yīng)溫度作為試驗因素，以水解度為指標，采用L16（35）正交試驗設(shè)計，對風味蛋白酶與水解蛋白酶酶解肝素廢水條件進行優(yōu)化，因素水平見表3，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

表3 L16（35）正交試驗因素水平

表4 風味-水解蛋白酶水解肝素廢水正交試驗結(jié)果

表5 L16（35）正交試驗結(jié)果方差分析

從極差分析正交試驗的方差分析（表5）可以看出，五因素對水解度的影響程度不同，影響的主次順序也不盡相同。其中酶總濃度和風味蛋白酶與水解蛋白酶量之比對水解度影響較大。各因素影響程度由大到小順序為 C（風味、水解蛋白酶比例）＞B（酶總濃度）＞D（時間）＞A（pH 值）＞E（溫度），最佳試驗條件為 A2B3C1D1E1。根據(jù) Ki分析的最佳組合為A1B3C3D3E1，用A1B3C3D3E1組合進一步試驗，得腸膜肽水解度為16.18%。所以，風味蛋白酶與水解蛋白酶酶解肝素廢水最佳組合為 A2B3C1D1E1，即酶總濃度3%，風味、水解蛋白酶比例為1：1，酶解溫度50℃，pH值5.0，酶解時間2 h，此條件下的水解度為17.45%。

關(guān)于腸膜蛋白的提取，舒夏娃等（2007）選用木瓜蛋白酶對豬小腸黏膜提取肝素后的下腳料進行水解，結(jié)果表明，影響水解度的主次因素順序為：溫度＞底物濃度＞酶加量＞pH值，最佳的水解條件下的水解度為20.63%，此時底物濃度為6%。本試驗得到的蛋白水解度偏低可能是由于底物濃度較低，而且由于原料性質(zhì)的限制，未對底物濃度對酶解的效果進行考察。王春維等（2005）通過胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對豬腸膜水解效果研究表明,木瓜蛋白酶優(yōu)于胰蛋白酶,影響木瓜蛋白酶水解度的主次因素順序為：時間＞溫度＞pH值，最適條件下的蛋白水解度為83.45%?？梢?，蛋白水解度與底物的濃度，蛋白的含量有很大關(guān)系。

3 結(jié)論

確定風味-水解蛋白酶為最適水解酶。采用單因素及正交試驗方法確定風味蛋白酶與水解蛋白酶復(fù)合酶酶解肝素廢水的最適條件，即酶總濃度3%，風味、水解蛋白酶比例為1：1，酶解溫度 50℃，pH值5.0，酶解時間2 h。在此條件下水解度為17.45%。

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