劉淮德 劉 梅 王寶杰 蔣克勇 張國范 王 雷

中國明對蝦主要分布在我國黃渤海和朝鮮西部沿海，南海部分海域也有少量存在，是我國重要的海水養(yǎng)殖對蝦之一。中國明對蝦是中國的特產，也是重要的出口水產品，無論是品質還是市場價格都遠遠高于其他養(yǎng)殖對蝦品種，其最高養(yǎng)殖年產量曾達到近20萬噸。而隨其養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，對蝦疾病的發(fā)生越來越頻繁，1993年爆發(fā)的病毒性流行病，使中國明對蝦的養(yǎng)殖遭受毀滅性打擊，此后始終未能全面恢復。近年來，隨著生態(tài)養(yǎng)殖和健康養(yǎng)殖的發(fā)展，一些微生態(tài)制劑開始應用于水產養(yǎng)殖，以改善養(yǎng)殖環(huán)境，減少病害和提高免疫力。目前有關微生物制劑的研究與開發(fā)在國內外均得到很大的重視，市場上已有大量用于水產養(yǎng)殖的專用產品銷售。水產微生態(tài)制劑是以后水產養(yǎng)殖病害防治的發(fā)展方向，但其被水產動物口服后的作用機理并不十分清楚。了解對蝦腸道微生物區(qū)系微生物的組成、結構及其生理功能如何，在此基礎上可以進一步研究外源有益微生物制劑對其影響，將有助于微生態(tài)制劑在水產養(yǎng)殖中的有效應用與推廣。

隨著水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和分子生物學技術的成熟，利用分子生物學手段研究腸道微生物組成日益成為熱點。水產動物的腸道內存在著大量的微生物，腸道微生物區(qū)系的動態(tài)平衡是動物保持健康和正常生長所必需的條件，腸道內有益微生物群對宿主起著屏障、營養(yǎng)和免疫等作用。本文采用不依賴培養(yǎng)的分子生物學手段16S rRNA基因克隆文庫法，分析中國明對蝦腸道群落組成，以期為水產微生態(tài)制劑的使用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集與處理

海捕中國明對蝦，于2008年夏天購自青島小港水產品市場，為健康對蝦成體，雄性，平均體長為12 cm，購回的活體蓄養(yǎng)空腹后于超凈臺內用70%乙醇進行體表消毒后，無菌條件下解剖取出腸道。

1.1.2 主要試劑和儀器

PCR 儀（PTC-100），GelDoc凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

DNA純化試劑盒購自上海生工，質粒pMD18-T，限制性內切酶（MspI和HhaI）購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 腸道微生物總DNA的提取

取200 mg腸道樣品，液氮研磨，加入l ml PBS(pH 值 7.4，0.1 mol/l磷酸鈉緩沖液) 和 20 μl 20%PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)，充分均質化后200×g離心6 min，取上清；沉淀中再加人1 ml PBS，離心，取上清；合并兩次上清，再次300×g離心6 min，取上清；再以12 000×g離心6 min收集菌體，并用PBS洗滌。在得到的菌體中加入300 μl裂解液I(150 mM NaCl，100 mM EDTA·Na2，pH 值 8.0)、10%溶菌酶 100 μl和1%RNaseA 20 μl，混勻后37℃保溫 30 min。加入300 μl裂解液 II(100 mM NaC1，500 mM Tris-HCl，pH 值 8.0)及50 μl 20%SDS（十二烷基磺酸鈉）和 50 μl 20%PVPP，混勻后冰浴5 min。加入等體積Tris飽和酚：氯仿：異戊醇為25：24：1溶液，13 000×g離心8 min，取上清；再加入等體積氯仿：異戊醇(24：1)，13 000×g離心 8 min，取上清(重復操作 1 次)。加入1/10體積3 M醋酸鈉及兩倍體積乙醇，－20℃沉淀2 h以上。15 000×g離心15 min，70%乙醇洗滌1次，超凈臺下干燥沉淀。沉淀用40 μl TE(100 mmol/l Tris-HCl,1 mmol/l EDTA,pH值8.0)溶解，－20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 16S rRNA基因的PCR擴增

PCR 引物：27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTC-3';M=A 或 C）；1387R（5'-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3';W=A或T）。

PCR 體系：無菌雙蒸水 34.5 μl，10×PCR 緩沖液5 μl，2.5 mmol/l dNTP 4 μl，2.5 μmol/l PCR 引物各 2 μl，Taq 酶 0.5 μl，模板 DNA 2 μl。反應條件：94 ℃ 預變性 4 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72℃10 min。PCR產物用1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳，切下條帶，用上海生工膠回收試劑盒回收。

1.4 16S rDNA克隆轉化和文庫構建

按照pMD18-T載體試劑盒說明，將純化后的產物與載體pMD18-T連接后，轉化到大腸桿菌E.coli Top10中。

1.5 陽性克隆子的RFLP分析

用菌落PCR方法驗證16S rRNA基因文庫中的陽性克隆。選擇通用引物T7和SP6擴增pMD18-T載體多克隆位點之間的序列，擴增條件同上。擴增產物用4堿基限制性內切酶MspI和HhaI進行酶切消化(37℃過夜)，酶切產物用3%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.6 DNA測序和分析

挑取代表性克隆，送上海生物工程有限公司進行序列測定，根據測序結果，計算文庫的覆蓋率。測定的序列在NCBI數據庫中用BLAST程序進行相似性搜索，從中選擇相近的典型菌株16S rRNA序列，用Clustal X軟件進行多重序列比對，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結果和分析

2.1 總DNA的抽提

腸道微生物基因組總DNA提取電泳圖見圖1?？侱NA經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，在大于10 kb處出現條帶。

2.2 16S rDNA片段的擴增

總DNA的PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現均獲得了特異性擴增片段。從圖2中可以看出，片段大小在1 500 bp左右，且沒有非特異性擴增現象,得到的PCR擴增產物適合下一步16S rDNA克隆文庫的構建。

2.3 16S rDNA基因克隆文庫分析

從文庫中挑選60個白色菌落，菌落PCR檢測到陽性克隆為55個。根據樣品酶切片段大小和數量區(qū)別電泳條帶譜型，結果表明，在中國明對蝦腸道16S rDNA文庫55個陽性克隆共有13種細菌RFLP譜型。

以覆蓋率(C)來評估所構建的文庫對環(huán)境微生物多樣性的體現，計算公式為：

式中，N代表所分析的克隆數，n1代表具有不重復序列的克隆數 (16S rDNA序列＞97%為重復序列)。計算結果表明，所構建的16S rDNA克隆文庫覆蓋率達到76.36%，即包含了對蝦腸道中76.36%的細菌多樣性狀況。因此，從覆蓋率分析可以說明所構建的16S rDNA克隆文庫能夠較完整地反映所屬環(huán)境中的細菌多樣性狀況。

2.4 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

挑選具有代表性的克隆子測序，去除載體序列部分，將所得序列在GenBank中進行BLAST分析，搜索相關序列，比對結果如表1所示。55個陽性克隆子與GenBank數據庫中已知16S rDNA序列相似性最高為99%，最低為87%；其中31個克隆子與已知序列相似性高于98%，其余克隆子(24個，占43.6%)與已知序列同源性低于94%。測序55克隆，弧菌22克隆，占40.0%，柔膜細菌11克隆，占20.0%，光合細菌3克隆，占54.5%，不可培養(yǎng)細菌19克隆，占34.5%。結果顯示中國明對蝦腸道優(yōu)勢菌為弧菌，其次為不可培養(yǎng)細菌和柔膜細菌。

表1 部分中國明對蝦腸道微生物DNA文庫比對結果

3 討論

對蝦腸道微生物的早期研究主要是傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，而近年來分子方法開始被大多數人采用。普遍認為水生無脊椎動物腸道微生物的組成為弧菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬、微球菌屬和氣單胞菌屬。Yasuda等（1980）發(fā)現幼蝦中，弧菌屬占優(yōu)勢，而成年蝦中，假單胞菌屬占優(yōu)勢；Dempsey等（1989）發(fā)現，弧菌屬、產堿菌屬、氣單胞菌屬、發(fā)光桿菌屬和假單胞菌屬為蝦腸道優(yōu)勢種群；王祥紅等（2000）發(fā)現，弧菌屬和發(fā)光桿菌屬在野生中國明對蝦腸道中為優(yōu)勢菌屬。Moss等（2000）發(fā)現，對蝦腸道優(yōu)勢菌為弧菌屬、氣單胞菌屬和假單胞菌屬。Oxley等（2002）研究發(fā)現，野生和養(yǎng)殖對蝦有相似的腸道微生物組成，包括氣單胞菌屬、發(fā)光桿菌屬、假單胞菌屬和弧菌屬。Esiobu發(fā)現，健康的桃紅對蝦腸道中優(yōu)勢菌為弧菌屬。這些研究都是采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，然后鑒定得到優(yōu)勢種群。李志勇等（2005）發(fā)現，不同對蝦及同一種對蝦的鰓部與腸道內的細菌組成差異性非常大；而羅鵬等（2006）經比較研究發(fā)現，凡納濱對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)內不同環(huán)境的優(yōu)勢種群十分明顯。兩者采用的都是PCR-DGGE方法，但僅僅比較了不同對蝦之間的腸道微生物組成差異，并沒有比較分析對蝦腸道微生物中各種群之間的關系。本研究采用16S rDNA基因文庫法分析中國明對蝦腸道微生物區(qū)系組成，結果與前人研究結果基本一致，采用分子生物學方法得到一些不可培養(yǎng)細菌的信息，更貼近真實情況，但是由于所選陽性克隆數較少，文庫的覆蓋率為76.36%，如果能再增加陽性克隆數目，就能更加完整地反映腸道微生物區(qū)系的真實組成。

16S rRNA基因克隆文庫技術現在已經廣泛地用于各種生態(tài)系統(tǒng)微生物組成的多樣性研究中，例如人們在對廢水處理系統(tǒng)、土壤、海洋、人體胃腸道系統(tǒng)等生態(tài)系統(tǒng)中的微生物進行研究時都用到該技術。目前，基于16S rRNA基因克隆文庫的分析方法是用于調查一個環(huán)境樣品中微生物組成情況的常用方法。

在水產養(yǎng)殖中，應用克隆文庫技術可建立一種不依傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術而能原位揭示對蝦體內細菌種群組成的分子診斷技術和病原菌分子診斷技術。通過檢測水產動物腸道正常微生物區(qū)系組成，建立基于機體內優(yōu)勢菌群結構的健康水產動物評價技術。還可檢測水產動物腸道微生物的動態(tài)變化和病害后微生物區(qū)系組成的差異，以及使用微生態(tài)制劑前后微生物區(qū)系組成的差異，為水產動物健康養(yǎng)殖提供理論依據。通過對蝦腸道內細菌群落結構的揭示將為新的水產微生物制劑菌株的開發(fā)和應用提供候選菌株和理論基礎。

4 結論

本文采用不依賴于培養(yǎng)的分子生物學手段16S rRNA克隆文庫法分析中國明對蝦腸道微生物群落組成。從中國明對蝦腸道中提取微生物基因組DNA，以細菌16S rRNA基因通用引物27F/1387R擴增16S rRNA基因序列，構建16S rRNA基因文庫。結果表明，中國明對蝦腸道微生物主要由弧菌、光合細菌、不可培養(yǎng)細菌組成，弧菌為優(yōu)勢菌。16S rRNA克隆文庫法能夠反映對蝦腸道微生物中種群的組成關系，是研究水產動物腸道微生物區(qū)系組成的可行方法。

17篇，刊略，需者可函索）