遲淑艷 譚北平 麥康森 艾慶輝 黃世標 周歧存 董曉慧 楊奇慧

當飼料中的魚粉被其它動植物蛋白源部分或全部替代時會產(chǎn)生氨基酸的缺乏，導致動物所需氨基酸不平衡。添加氨基酸可以避免蛋白源替代而產(chǎn)生的氨基酸不平衡的問題。然而，游離氨基酸的溶失已經(jīng)成為尋求對蝦氨基酸適宜添加量的主要障礙[1-3]。解決溶失問題的途徑之一即對氨基酸進行包被。目前，對氨基酸進行包被的壁材分別有屬于糖類的鄰苯二甲酸醋酸纖維素（CAP）[4-5]、角叉菜膠[1]、羧甲基纖維素（CMC）[1]、淀粉、環(huán)糊精[6]；蛋白質(zhì)類的玉米蛋白、瓊脂、酪蛋白-明膠[1]；脂類的棕櫚酸三酰甘油酯（TPA）[4,7]、丙烯酸樹脂[8]和硬化油脂[9]等。這些壁材各具不同特性，可以單獨使用，也可以搭配使用，起到不同程度的緩釋作用。在使用這些壁材進行包被時可采用單凝聚法、復相乳化法 (干燥浴法)、溶劑蒸發(fā)法和噴霧干燥法。形成的微膠囊由于壁材、包被效果、工藝參數(shù)以及飼喂的對象不同使每種微膠囊產(chǎn)品有著不同的效果。

本文重點在于采用化學方法中的復相乳化法篩選明膠微囊蛋氨酸的工藝參數(shù)以獲取影響蛋氨酸微囊工藝的主要因素。為優(yōu)化蛋氨酸微囊的制備工藝提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

本實驗選用明膠、羧甲基纖維素鈉為壁材對蛋氨酸進行包被。液體石蠟（天津科密歐化學試劑有限公司生產(chǎn)，AR）；明膠（Gelatin，GT國藥集團化學試劑有限公司，CP）；羧甲基纖維素鈉（Sodium carboxymethyl cellulose，CMC，廣東汕頭市西隴化工廠生產(chǎn)，CP）；L-蛋氨酸（Methionine,MET,天津市福晨化學試劑廠生產(chǎn),生化試劑）；花生油（金龍魚牌）；Span80(天津市福晨化學試劑廠生產(chǎn)，CP)；異丙醇(廣州化學試劑廠生產(chǎn)，AR)；乙醚（國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，AR）。

主要儀器設(shè)備有：電磁攪拌器（JD-3，上海理達儀器廠生產(chǎn)）；電熱恒溫水浴箱(XMTD，東方電工儀器廠生產(chǎn))；電子天平（Shimadzu，日本）；雙目光學顯微鏡（Nikon YS100，日本）；顯微鏡專用高清晰數(shù)字攝像機（YM130 Digital camera，易創(chuàng)電子）；電熱爐（天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)）；數(shù)顯鼓風干燥箱（GZX-9240MBE，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)）。

2 微囊蛋氨酸制備工藝

2.1 制備工藝

明膠微膠囊的制備采用復相乳化法，此方法首先由 Tanaka（1963）[10]提出，操作參考 Kerpert等（1993）[11]中的制備流程。制備流程見圖1。

2.2 參數(shù)優(yōu)化

本實驗采用均勻?qū)嶒炘O(shè)計[12]，以明膠為包被壁材，蛋氨酸為芯材，在完成多次預備實驗基礎(chǔ)上，結(jié)合實際條件，確定主要實驗因素及范圍：①明膠溶液濃度3%～7%(W： V)；②液體石蠟與(油相+水相)比例 1：1～3： 1(V： V)；③蛋氨酸與明膠質(zhì)量比：1： 1～3： 1(W： W)；④乳化時間 10～30 min。

將上述4個因素分成9個水平（見表1），通過均勻?qū)嶒炘O(shè)計表，將表1的因素和水平數(shù)值按照表2安排實驗，每個實驗號做3個重復。實驗?zāi)康氖怯^測明膠蛋氨酸微球的外觀特征和測出平均載藥量。

表1 因素和水平

表2 均勻?qū)嶒炘O(shè)計

3 檢測指標

載藥量(Drug Loading,DL)（%）=微膠囊含蛋氨酸的質(zhì)量/微膠囊質(zhì)量×100。

樣品中蛋氨酸含量由廣東粵海飼料集團有限公司水產(chǎn)動物飼料工程技術(shù)研究開發(fā)中心進行測定（Agilentl100高效液相色譜儀）。

4 結(jié)果分析

4.1 明膠微球外表與形狀

實驗結(jié)果顯示，各處理組樣本顏色均為純白色，在顯微鏡下觀察微球外表形狀，發(fā)現(xiàn)外表一般呈不規(guī)則形狀，多數(shù)呈現(xiàn)凹凸不平或者微球間相互粘連成各種形態(tài)，光滑度一般；微球中央部位不透光，呈黑色囊心物，邊緣處呈半透光。小部分出現(xiàn)聚集，粘連現(xiàn)象。組內(nèi)重復性樣品間整體形狀與外觀基本一致；不同處理組間外觀差異性隨著制備參數(shù)不同呈現(xiàn)一定差異。

圖2是選取處理組4、7明膠微膠囊在光學顯微鏡成像系統(tǒng)放大10×10倍下的形態(tài)比較；圖片A、B為處理組4的樣品微球，圖片C、D為處理組7的樣品微球；從圖2中可以看出，光鏡下處理組4微球外觀較好，基本呈圓形，表面粗糙程度較?。惶幚斫M7微球外觀圓整度一般，呈不規(guī)則形，表明粗糙程度較大。

4.2 明膠微囊包封率、載藥量和粒徑分析

表3 明膠蛋氨酸微球制備效果分析（%）

由表3可知，各處理組的包封率比較理想，組間無顯著性差異(P＞0.05)；處理4的60目篩下物所占比例最大，達57.43%，除處理8外，它顯著高于其它組（P＜0.05）。處理4的載藥量最高，與處理9差異不顯著，但顯著高于其他處理組(P＜0.05)。

不同處理組間粒徑大小隨著實驗參數(shù)不同而不同，從過篩情況來看，圖3 顯示處理組 1、4、5、6、8 過篩率分別為 53.23%、57.43%、53.09%、51.07%、55.32%，表明上述處理組微球粒徑較小，總體制備效果較好；而處理組 2、3、7、9 過篩率分別為：22.32%、42.18%、16.59%、12.95%，表明上述處理組微球過篩率較低，粒徑普遍較大，總體制備效果欠佳。

將實驗參數(shù)用線性回歸分析統(tǒng)計法進行統(tǒng)計，設(shè)載藥量為Y值。由于實驗參數(shù)最大值與最小值間相差30倍，直接用回歸分析結(jié)果不太理想，故對參數(shù)取對數(shù)后再進行回歸分析，得到回歸方程：

由回歸方程可見，方程中X1（A）、X2（B）、X3（C）、X4（D）的系數(shù)均為正值，表明4個影響因素在一定程度與載藥量呈正比例關(guān)系；在一定范圍內(nèi)取正值越大，載藥量越高；方程中X1的系數(shù)最大，表明明膠溶液濃度是影響載藥量的最主要因素。

根據(jù)均勻設(shè)計實驗方案的考察范圍，結(jié)合實踐經(jīng)驗，經(jīng)綜合考慮，確定制備微囊蛋氨酸的優(yōu)化條件為:X1=7、X2=2： 1、X3=3： 1、X4=30，代入上述方程中，得預測值Y=67.55%，經(jīng)再次實驗，得平均實際包囊率為61.30%.

5 討論和結(jié)論

閆征等（2006）[13]以海藻酸鈉和無水氯化鈣為壁材用擠壓法制備蛋氨酸微膠囊時認為，海藻酸鈉濃度和固化液濃度是影響載藥量的主要因素。而本實驗采用了化學復相乳化法對蛋氨酸進行包被。復相乳化法借助恒溫磁力攪拌器外力的作用，使混合均勻的明膠蛋氨酸溶液液滴在液體石蠟中均勻分散、乳化成小液滴，兩相間界面張力使液滴體積增加到最大，液滴為降低界面能，只能保持球形(相同體積幾何體中球體表面積最小)；在乳化過程結(jié)束后進行降溫冷卻，球形液滴即固化成微球，接著加入異丙醇和乙醚，依次把微球的水分和油脫去，通過抽濾的方法使明膠微球從油水中分離出來。陸揚（2006）[14]認為，復相乳化法制備明膠微球的關(guān)鍵因素是乳液的形成和凝聚，因為乳液液滴的大小決定了微球的直徑，而液滴的外形、穩(wěn)定性和冷凝時發(fā)生的變化則影響微球的形態(tài)。本實驗通過均勻設(shè)計對明膠溶液濃度、液體石蠟與(水相+油相)比例以及蛋氨酸與明膠質(zhì)量進行組合搭配篩選適宜的乳液成分與濃度，得出明膠濃度對制備工藝的影響更為關(guān)鍵，制備出載藥量達61.30%的微膠囊產(chǎn)品。研究表明，乳液的形成受到水相和油相濃度及比例的影響，其中明膠的濃度影響最大。實驗中采用的明膠是天然高分子聚合物，屬常用的藥劑輔料，無色、無味、半透明，不溶于有機溶劑，由于具備凝膠性、固水性、粘結(jié)性和溶解性等多種特性，使其在醫(yī)藥行業(yè)有廣泛的用途，其中最主要的有硬膠囊、軟膠囊、代血漿和包衣等。明膠的濃度可以通過影響水相的粘度，來影響凝聚物的流動性[15]，因此，可能對載藥量產(chǎn)生了一定的影響。同時，楊愛華等（2003）[16]認為，明膠加入糖衣中,隨著藥品貯藏時間的延長會變成一種堅實的膜,在酸液中不易破裂而影響芯材溶出。這將在明膠微膠囊后期的使用中進行驗證。

[1]Alam M S,Teshima S,Koshio S.Effects of supplementation of coated crystalline amino acids on growth performance and body composition of juvenile kuruma shrimp Marsupenaeus japonicus[J].Aquaculture nutrition,2004,10：309-316.

[2]Lim C.Effect of dietary pH on amino acid utilization by shrimp(penaeus vannamei)[J].Aquaculture,1993,114：293-303.

[3]Teshima S I,Ishikawa M,Alam M S.Supplemental effects and metabolic fate of crystalline arginine in juvenile shrimp,Marsupenaeusjaponicus [J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Biochemistry and Molecular Biology,2004,137：209-217.

[4]Segovia-Quintero M A,Reigh R C.Coating crystalline methionine with tripalmitin-polyvinyl alcohol slows its absorption in the intestine of Nile tilapia,Oreochromis niloticus [J].Aquaculture,2004,238:355-367.

[5]Deng J M,Mai K S,Ai Q H,et al.Effects of replacing fish meal with soy protein concentrate on feed intake and growth of juvenile Japanese flounder,Paralichthys olivaceus [J].Aquaculture,2006,258:503-513.

[6]陳丙愛,冷向軍,李小勤,等.晶體或包膜氨基酸對鯉魚的作用效果研究[J].水生生物學報，2008,32(5):774-778.

[7]劉永堅,劉棟輝,田麗霞,等.草魚飼料中結(jié)晶和包膜賴氨酸的生物效應(yīng)[J].水產(chǎn)學報,1999,23(增刊):51-56.

[8]郭玉琴.蛋氨酸和賴氨酸過瘤胃保護及其效果評價研究[博士學位論文].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2006:12.

[9]王冠,冷向軍,李小勤,等.飼料中添加包膜氨基酸對異育銀鯽生長和體成分的影響[J].上海水產(chǎn)大學學報，2006,15（3）:365-369.

[10]Tanaka N,Takino S&Utsumi I.A new oral gelatinized sustained-release dosage form [J].Pharm.Sci.,1963,52(7):664-667.

[11]Kerpert S,Melegari P.Preparation and Characterization of Oilcontaining Microparticles [J].Drug Development And Industrial Pharmacy,1993,19:603-621.

[12]方開泰.均勻設(shè)計與均勻設(shè)計實驗表[M].北京：科學出版社,1994:35-49.

[13]閆征,過世東.蛋氨酸微膠囊的制備及其釋放效果的研究[J].糧食與飼料工業(yè)，2006(1)：36-37.

[14]陸揚.明膠微球的研究進展[J].明膠科學與技術(shù),2006，26(2):57-68.

[15]鄧岳松,許梓榮.水生動物明膠-羧甲基纖維素鈉微型膠囊餌料制備工藝[J].內(nèi)陸水產(chǎn)，2000(10)：21-22.

[16]楊愛華,宋澤運,李林.紅霉素腸溶片包衣處方工藝[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2003,23(12):715-716.