白 赟 ，李艷彥 ，高 麗 ，王永輝 ，周 然

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065； 2.山西中醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030024）

黃芪桂枝五物湯出自《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治》，是一首既振奮陽(yáng)氣、溫運(yùn)血行，又調(diào)暢營(yíng)衛(wèi)的代表方劑，其主治病證的病機(jī)在于陽(yáng)氣不足，寒邪凝滯，血行不暢。實(shí)驗(yàn)研究表明，黃芪桂枝五物湯對(duì)于凍瘡模型有很好的治療作用［1］，根據(jù)黃芪桂枝五物湯的功效及所治病證的病機(jī)，如在凍傷模型基礎(chǔ)之上復(fù)加氣虛因素，則與黃芪桂枝五物湯所治病證從理論上來(lái)說(shuō)更加吻合。所以本課題擬建立氣虛凍傷模型，并研究黃芪桂枝五物湯對(duì)氣虛凍傷模型的治療作用及其機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠30只，雌雄兼有，體重（230±10）g，動(dòng)物合格證號(hào)為 SCXK（京）2004-0002，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。所有動(dòng)物提前1 w購(gòu)入，分籠飼養(yǎng)，5只/籠。光照節(jié)律 12L∶12D（6∶00～18∶00），室溫（19±2）℃，室內(nèi)保持安靜。

1.1.2 試劑與儀器 TXB2、6-k-PGF1α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，均購(gòu)自中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所（批號(hào)：20060725）。DC-2006低溫恒溫槽（寧波新芝生物科技股份有限公司），Spectramax190連續(xù)光譜酶標(biāo)儀 （美國(guó)分子儀器公司），SA-6000血流變檢測(cè)儀（北京賽科希德科技發(fā)展有限公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 黃芪桂枝五物湯由黃芪9 g，芍藥 9 g，桂枝 9 g，生姜 18 g，大棗 3枚組成，藥材購(gòu)自山西省藥材公司，經(jīng)鑒定均為正品。本藥物按原書方中諸藥用量比例，采用傳統(tǒng)水煎濃縮干燥法制成顆粒劑（由山東大洋制藥有限公司加工），每克顆粒劑相當(dāng)于生藥材劑量6.9 g，配制后含生藥材濃度為0.375 g/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與造模 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，將30只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、氣虛凍傷模型組、黃芪桂枝五物湯組3組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余兩組均制備氣虛凍傷模型。氣虛凍傷模型為在氣虛模型基礎(chǔ)上復(fù)加了凍傷的因素。氣虛模型采用過(guò)度疲勞聯(lián)合飲食失節(jié)的方法。實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物進(jìn)行預(yù)游泳，剔除游泳時(shí)間少于10 min、大于20 min的大鼠。合格造模大鼠于每天上午10∶00置于盛有溫水 （22±1）℃的大塑料桶中游泳 10 min，隔日喂食（隔日禁食，隔日足量給食），連續(xù)2 w。接著再按凍傷模型的制備方法進(jìn)行［1］，將除正常對(duì)照組以外的大鼠四肢置于800 mL水和400 mL無(wú)水乙醇混合的-2℃的低溫恒溫槽內(nèi)，冷凍1.5 min后取出，1次即造模成功。正常對(duì)照組動(dòng)物不施加任何刺激，自然飼養(yǎng)。造模后第2天，各組動(dòng)物開始給藥，黃芪桂枝五物湯組按相當(dāng)于生藥材4.7 g/（kg·d）體重給予灌胃，正常對(duì)照組和氣虛凍傷模型組給予等量蒸餾水，每日2次。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo) 給藥3 d后，各組大鼠用20%烏拉坦100 mg/kg體重腹腔注射麻醉后，下腔靜脈取血5 mL，取2 mL肝素抗凝，用SA-6000血流變檢測(cè)儀檢測(cè)全血黏度、血漿黏度、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞聚集指數(shù)及紅細(xì)胞變形指數(shù)等指標(biāo)；剩余血液3 000 rpm/min離心15 min，分離血清，照Elisa試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)大鼠TXB2和6-k-PGF1α含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 黃芪桂枝五物湯對(duì)氣虛凍傷模型大鼠血流變的影響

結(jié)果見表1。

表1 黃芪桂枝五物湯對(duì)氣虛凍傷模型大鼠血流變的影響 （±s）

表1 黃芪桂枝五物湯對(duì)氣虛凍傷模型大鼠血流變的影響 （±s）

注：與正常對(duì)照組比較，1）P<0.01；與氣虛凍傷模型組比較，2）P<0.05，3）P<0.01

1 200正常對(duì)照組 52.19±9.12 3.79±0.67 1.66±0.0.37 0.39±0.03 6.23±0.68 1.54±0.39氣虛凍傷模型組 83.25±21.031）7.23±1.561）3.24±1.251） 0.42±0.06 10.28±1.231）0.83±0.141）黃芪桂枝五物湯組 66.83±13.403）5.06±0.992）1.82±0.433） 0.39±0.03 7.83±0.593）1.12±0.203）組別 全血黏度切變率（mPa·s）血漿黏度（mPa·s）紅細(xì)胞壓積（L/L）紅細(xì)胞聚集指數(shù)紅細(xì)胞變形指數(shù)

由表1可以看出，造模后第3天，與正常對(duì)照組比較，氣虛凍傷模型組大鼠全血黏度（高切、低切）、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著升高（P<0.01），紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著降低（P<0.01）；與氣虛凍傷模型組比較，黃芪桂枝五物湯組大鼠全血黏度 （低切、高切）、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著降低（P<0.05，P<0.01），紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著升高（P<0.01）。

2.2 黃芪桂枝五物湯對(duì)氣虛凍傷模型大鼠TXB2、6-k-PGF1α 的影響

結(jié)果見表2。

表2 黃芪桂枝五物湯對(duì)氣虛凍傷模型大鼠TXB2、6-k-PGF1α的影響 （±s）

表2 黃芪桂枝五物湯對(duì)氣虛凍傷模型大鼠TXB2、6-k-PGF1α的影響 （±s）

注：與正常對(duì)照組比較，1）P<0.01；與氣虛凍傷模型組比較，2）P<0.05，3）P<0.01

組別 n正常對(duì)照組 10氣虛凍傷模型組 10黃芪桂枝五物湯組 10 TXB2（pg/mL）6-k-PGF1α（pg/mL）192.38±29.67 5.27±1.09 359.68±44.601） 2.45±0.261）251.83±65.353） 3.65±0.872）

由表2可以看出，造模后第3天，與正常對(duì)照組比較，氣虛凍傷模型組6-k-PGF1α顯著降低 （P<0.01），TXB2顯著升高（P<0.01）；與氣虛凍傷模型組比較，黃芪桂枝五物湯組6-k-PGF1α的水平顯著升高（P<0.05），TXB2顯著降低（P<0.01）。

3 討 論

凍傷是由寒冷所致的末梢部局限性炎癥性皮膚病，主要癥狀是手指、足趾、足緣、耳廓處，因受寒冷刺激，出現(xiàn)紫紅色水腫性紅斑，邊界不清，邊緣常呈鮮紅色，壓之褪色、遇熱劇癢。嚴(yán)重者在紅斑的基礎(chǔ)上伴有水皰，糜爛或潰瘍。中醫(yī)理論認(rèn)為，凍傷乃皮膚肌肉受寒邪侵襲，經(jīng)絡(luò)阻滯，氣血運(yùn)行不暢，血凝氣滯，肌膚失養(yǎng)所致。氣虛凍傷為在氣虛基礎(chǔ)上復(fù)加凍傷因素，而黃芪桂枝五物湯證的病機(jī)在于陽(yáng)氣不足，寒邪凝滯，血行不暢，與氣虛凍傷的病機(jī)較吻合。

3.1 黃芪桂枝五物湯對(duì)氣虛凍傷模型大鼠血流變的影響

血液作為一種含有血細(xì)胞的懸浮液體系統(tǒng)，其流變性特性首先表現(xiàn)為具有一定的流動(dòng)性和變形性。血流變的異常，將會(huì)引起機(jī)體血液循環(huán)障礙，其中尤以血液黏度為重要因素。血液黏度是衡量血流變的重要指標(biāo)，血液黏度的低與高反映血液運(yùn)輸?shù)膬?yōu)與劣或血液供應(yīng)的多與少。血液黏度愈高，循環(huán)阻力越高，血液流動(dòng)性愈差。血液黏度異常增加可引起血液循環(huán)及微循環(huán)障礙，尤其是微循環(huán)灌流量下降，這必然會(huì)導(dǎo)致器官和組織缺血缺氧，影響組織的代謝和功能，從而產(chǎn)生疾病。全血黏度是反應(yīng)血液流變學(xué)基本特性的指標(biāo)，涉及到血漿黏度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集性和變形性、血小板聚集性等多種因素。通常認(rèn)為，高切變率下全血黏度的升高主要是由于紅細(xì)胞變形能力減低所致，低切變率下全血黏度的升高主要是由于紅細(xì)胞聚集增加所致［2］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，造模3 d后，氣虛凍傷模型大鼠全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著性升高，紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著性降低。說(shuō)明局部皮膚凍傷后引起了血液黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)的增加，使紅細(xì)胞變形能力降低。由于這些改變，使循環(huán)阻力加大，血流減慢，造成微循環(huán)灌流障礙，使組織出現(xiàn)缺血、缺氧而壞死。而黃芪桂枝五物湯能顯著降低氣虛凍傷模型全血黏度、血漿黏度紅細(xì)胞聚集指數(shù)，顯著升高紅細(xì)胞變形指數(shù)。說(shuō)明黃芪桂枝五物湯對(duì)于氣虛凍傷模型在血流變方面均有一定的改善作用。

3.2 黃芪桂枝五物湯對(duì)氣虛凍傷模型大鼠TXB2、6-k-PGF1α 的影響

凍傷后血液循環(huán)障礙、血栓形成是造成組織損傷的主要原因，不同程度凍傷伴隨不同程度的凝血系統(tǒng)變化。TXA2不僅是很強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，也是一種引起血小板集聚的因子；而PGI2有較強(qiáng)的擴(kuò)張血管及抑制血小板積聚的作用。生理狀態(tài)下，TXA2和PGI2二者保持一定的比例，成為維持血液循環(huán)穩(wěn)定的重要因素，在維持血管正常張力、血流量調(diào)節(jié)和組織灌注等方面起著重要作用［3］。PGI2分泌減少，TXA2增多，可導(dǎo)致血管痙攣加重，血栓形成加速，后者又可繼發(fā)性地激活血小板，催化釋放腎上腺素，反饋加速血小板聚集和血栓形成［4］，被認(rèn)為是中醫(yī)血瘀證病理的重要環(huán)節(jié)［5］。由于TXA2和PGI2半衰期極短，迅速分解為性質(zhì)穩(wěn)定的TXB2和6-k-PGF1α，通常通過(guò)測(cè)定血漿中TXB2和6-k-PGF1α水平來(lái)了解TXA2和PGI2的狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氣虛凍傷模型中6-k-PGF1α顯著降低，TXB2顯著升高，說(shuō)明氣虛凍傷會(huì)引起血管收縮，血小板聚集，血栓形成。黃芪桂枝五物湯能顯著升高氣虛凍傷模型6-k-PGF1α的水平，顯著降低TXB2。說(shuō)明黃芪桂枝五物湯對(duì)氣虛凍傷的作用機(jī)理可能是通過(guò)調(diào)節(jié)TXB2和6-k-PGF1α之間的平衡。中醫(yī)理論認(rèn)為氣能行血，血的運(yùn)行離不開氣的推動(dòng)作用，氣虛可使血行不暢而致血瘀，甚至瘀阻不行。黃芪是中醫(yī)補(bǔ)氣之要藥，具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)，提高免疫的作用［6］。且實(shí)驗(yàn)研究證明黃芪桂枝五物湯具有抗炎鎮(zhèn)痛作用［7］。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，黃芪桂枝五物湯對(duì)氣虛凍傷大鼠的治療作用，其可能的機(jī)理為通過(guò)對(duì)血循環(huán)的影響而達(dá)到益氣活血療傷的目的。

［1］李艷彥，王永輝，張永剛，等.黃芪桂枝五物湯不同給藥途徑對(duì)凍傷模型大鼠的影響及其作用機(jī)制［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2010，8（2）：181-185.

［2］王鴻儒.血液流變學(xué)［M］.北京：北京醫(yī)科大學(xué)、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1997：19-33.

［3］李麟仙.前列腺素在腦血管疾病發(fā)病中的作用［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，1986，17（2）：118-123.

［4］鄭小偉.中醫(yī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方法學(xué)［M］.上海：上海中醫(yī)藥大學(xué)出版社，1999.

［5］周永昌，翁心植.TXA2-PGI2的平衡與臨床［J］.中華內(nèi)科雜志，1987，26（1）：49.

［6］劉玉蓮，楊叢忠.黃芪藥理作用概述［J］.中國(guó)藥業(yè)，2004，13（10）：79.

［7］黃兆勝，施旭光，朱偉，等.黃芪桂枝五物湯及其配伍抗炎鎮(zhèn)痛的比較研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2005，16（2）：93-96.