張 超， 佟廣香，匡友誼，張春雷,3，尹家勝*

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

哲羅魚 Hucho taimen（Pallas）系鮭形目（Salmoniformes）、鮭科（Salmonidae）、哲羅魚屬（Hucho），是兇猛的大型冷水魚類。哲羅魚具有生長速度快、營養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)良特性，是冷水性魚類中較好的馴養(yǎng)品種，目前馴化養(yǎng)殖及人工繁育已經(jīng)獲得成功。哲羅魚繁殖[1]，生理學(xué)及染色體核型方面的研究國內(nèi)已有報(bào)道[2-4]，在分子生物學(xué)方面，國內(nèi)有利用微衛(wèi)星和AFLP對(duì)哲羅魚遺傳多樣性研究的報(bào)道[5-7]，國外有對(duì)虹鱒的性別基因位點(diǎn)及鮭科魚類性染色體進(jìn)行研究[8-11]，但在分析哲羅魚性別相關(guān)的分子標(biāo)記方面，尚未見有報(bào)道。

AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism of DNA）技術(shù)結(jié)合了RFLP的穩(wěn)定性和PCR的高效性，具有多態(tài)性豐富、DNA用量少、無需預(yù)知基因組的序列信息等特點(diǎn)[12]。已廣泛應(yīng)用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建[13]、遺傳多樣性分析[14]、重要性狀的分子標(biāo)記篩選等方面[15]。利用AFLP技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物性別相關(guān)分子標(biāo)記的尋找，國內(nèi)外研究相對(duì)較少。相關(guān)的研究主要集中在植物領(lǐng)域[16-17]。在水產(chǎn)動(dòng)物方面，僅在建鯉[18]、尼羅羅非魚[19-20]、半滑舌鰨[21-22]、虹鱒[10,23]、大西洋鮭[24]等幾種魚類中獲得與性別相關(guān)的分子標(biāo)記，且在這些獲得的標(biāo)記中，大部分標(biāo)記與性別的連鎖關(guān)系還有待于進(jìn)一步確定。而且有報(bào)道指出目前得到的一些性別特異標(biāo)記具有很高的種系特異性[20]。本研究利用AFLP技術(shù)分析雌雄哲羅魚DNA水平的差異，尋找與性別相關(guān)的分子標(biāo)記，以期為哲羅魚的性別鑒定及單性養(yǎng)殖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

哲羅魚雌雄各10尾，體長范圍為70.2～104 cm，體重范圍為2.428～12.680 kg，均采自黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚實(shí)驗(yàn)站，在性成熟期鑒定雌雄后剪取鰭條，于75%酒精中保存。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測

將鰭條樣品在超純水中反復(fù)清洗多次，使乙醇完全揮發(fā)，提取方法參照文獻(xiàn)[25]，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用分光光度計(jì)測定其純度和濃度，然后將DNA濃度調(diào)整至100 ng·μL-1備用。

1.2.2 AFLP分析

用限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ/TaqⅠ組合和Eco RⅠ/Tru9Ⅰ組合分別對(duì)基因組DNA進(jìn)行雙酶切，然后T4DNA連接酶進(jìn)行連接。具體操作步驟參照文獻(xiàn)[26]。接頭序列如下：

以連接產(chǎn)物為模板進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增引物和選擇性引物序列見表1，擴(kuò)增產(chǎn)物用10%聚丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺為29：1）凝膠電泳檢測，上樣5 μL，在恒壓（380 V）條件下電泳11 h后銀染，掃描儀成像。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Gel-pro4.5軟件分析獲得的AFLP電泳圖譜，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)100 bp DNA Ladder計(jì)算擴(kuò)增片段的大小。統(tǒng)計(jì)方法參照文獻(xiàn)[26]，用Philip3.6軟件和TreeView軟件進(jìn)行個(gè)體聚類分析，Bootstrap抽樣5 000次。

表1 引物序列Table1 Primers sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性分析

用25對(duì)E/PT引物組合和20對(duì)E/T引物組合對(duì)20尾哲羅魚個(gè)體進(jìn)行AFLP擴(kuò)增，25對(duì)E/PT引物組合共擴(kuò)增出了958個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)為251個(gè)，多態(tài)性比例在4.76%～62.26%之間，平均多態(tài)性比例為25.068%；20對(duì)E/T引物組合共擴(kuò)增出了971個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)為217個(gè)，多態(tài)性比例在6.98%～37.50%之間，平均多態(tài)性比例為22.175%，結(jié)果見表2。從表中可以看出，兩組酶切組合得出的結(jié)果相差不大，E/T引物組合擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)稍多于E/PT引物組合，但多態(tài)性位點(diǎn)比例稍低于后者。綜合兩組數(shù)據(jù)來看，這20尾哲羅魚之間的多態(tài)性位點(diǎn)比例并不是很高，多態(tài)水平一般。

表2 哲羅魚中不同引物組合擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)及多態(tài)性位點(diǎn)比例Table2 Number of loci and ratio of polymorphic loci amplified by different AFLP primers in H.taimen

圖1為引物組合E3-PT3擴(kuò)增的結(jié)果，圖2為引物組合E1-T8擴(kuò)增的結(jié)果，多態(tài)性比例分別為25.00%和41.46%。 圖中標(biāo)號(hào)1～10為雌魚，11～20為雄魚，箭頭所指處為多態(tài)位點(diǎn)，圖1中有兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，圖2中有一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，這三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在雌雄哲羅魚中擴(kuò)增出的比例存在一定的差異，說明這些多態(tài)位點(diǎn)與哲羅魚性別可能存在一定的相關(guān)性。

圖1 E3-PT3的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Electrophoretogram of H.taimen population amplified by primer combination E3-PT3

圖2 E1-T8的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Electrophoretogram of H.taimen population amplified by primer combination E1-T8

2.2 雌雄個(gè)體差異

分析45對(duì)引物組合的擴(kuò)增結(jié)果，有15個(gè)位點(diǎn)在雌性和雄性個(gè)體中出現(xiàn)的比例存在很大的差異（大于50%），如引物組合E3-PT6擴(kuò)增的分子質(zhì)量為115 bp的位點(diǎn)在10個(gè)雄性個(gè)體中出現(xiàn)8個(gè)，而10個(gè)雌性個(gè)體中僅有1個(gè)出現(xiàn)；引物組合E2-T2擴(kuò)增的分子質(zhì)量為603 bp的位點(diǎn)在10個(gè)雌性個(gè)體中都有出現(xiàn)，而在10個(gè)雄性個(gè)體中只出現(xiàn)3個(gè)，結(jié)果見表3。這15個(gè)位點(diǎn)中雖然沒有找到哲羅魚雌雄特異位點(diǎn)，但每個(gè)位點(diǎn)在雌雄中擴(kuò)增的比例相差都在50%以上，表明這些位點(diǎn)與哲羅魚性別存在很大的相關(guān)性，這些位點(diǎn)可能位于性染色體上或者性別決定基因附近區(qū)域。

利用popgene3.2版軟件計(jì)算雌雄兩個(gè)群體的觀測等位基因Na、有效等位基因Ne，Nei氏基因多樣性指數(shù)H和Shannon氏指數(shù)I，結(jié)果見表4、5。由表中可以看出，兩組酶切組合所得到的結(jié)果不同，E/PT組合獲得的遺傳多樣性參數(shù)是雌性略高于雄性，而E/T組合則是雄性略高于雌性，總體來看，兩組酶切組合得出的數(shù)據(jù)均較低，由此可以得出哲羅魚群體遺傳多樣性較低，但將雌雄群體分開來看，兩群體之間遺傳多樣性參數(shù)差異并不大，說明在進(jìn)化過程中雌雄群體的遺傳分化程度不大，所以從DNA角度來看，哲羅魚雌雄群體之間的差別不大，多態(tài)性水平一般。

表3 哲羅魚雌雄個(gè)體在15個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)的比例差異Table3 Differences of distribution in 15 loci between female and male groups of H.taimen

表4 E/PT組合獲得的遺傳多樣性參數(shù)Table4 Parameters of genetic diversity by E/PT combination

表5 E/T組合獲得的遺傳多樣性參數(shù)Table5 Parameters of genetic diversity by E/T combination

用Phylip3.6軟件計(jì)算遺傳距離，并進(jìn)行5 000次Bootstrap檢驗(yàn)系統(tǒng)樹的可靠性，圖3是由表3中的15個(gè)位點(diǎn)繪制的哲羅魚個(gè)體聚類圖。從圖3可以看出雌魚聚集在系統(tǒng)樹上部，雄魚聚集在系統(tǒng)樹下部，這說明相同性別的魚之間遺傳距離較近，優(yōu)先聚為一組，而與不同性別的魚之間的遺傳距離較遠(yuǎn)，這也同樣表明這15個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與哲羅魚性別之間存在很大的相關(guān)性。

圖3 哲羅魚個(gè)體聚類圖Fig.3 Individuals dendrogram of H.taimen

3 討論與結(jié)論

AFLP標(biāo)記技術(shù)能產(chǎn)生分布于整個(gè)基因組的分子標(biāo)記，位點(diǎn)豐富，但是操作過程繁瑣，任何一步的疏忽都會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。本試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[26]采用了最適的酶量、酶切時(shí)間、連接時(shí)間及選擇性擴(kuò)增時(shí)的稀釋倍數(shù)，將100 ng DNA用3 U的Eco RⅠ、3 U的TaqⅠ和Tru9Ⅰ分別先后酶切3、4 h，然后用2 U的T4DNA連接酶連接3 h，取3 μL連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，得到了最可靠的結(jié)果。

本研究用45對(duì)引物組合進(jìn)行試驗(yàn)分析，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)與性別相關(guān)的特異性位點(diǎn)，但某些位點(diǎn)在雌雄個(gè)體中出現(xiàn)的比例存在很大的差異。這些位點(diǎn)可能與哲羅魚的性別有一定的關(guān)聯(lián)，推測這些位點(diǎn)可能位于性別決定基因的相鄰區(qū)域，但與哲羅魚遺傳性別的確切關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。雌雄個(gè)體出現(xiàn)比例差異較大的15個(gè)位點(diǎn)的聚類分析結(jié)果也表明雌雄個(gè)體具有一定的遺傳分化，同性個(gè)體優(yōu)先聚類。

鮭科魚類性別方面的研究多是國外學(xué)者們進(jìn)行的，主要集中在對(duì)虹鱒的研究。Iturra等利用RAPD方法獲得兩個(gè)虹鱒雄性特異分子標(biāo)記，并將其中一個(gè)標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，命名為OmyP9，然后將其作為探針，采用FISH法將該標(biāo)記定位于Y染色體上[10]；同時(shí)，還采用FISH法，利用虹鱒的性別標(biāo)記OmyP9和5s rDNA、GH2基因作為FISH法的探針，特征化了虹鱒性別染色體，并鑒別了銀大麻哈魚的性染色體[27]，這表明OmyP9這個(gè)性別標(biāo)記在虹鱒和銀大麻哈魚中可以通用。虹鱒和銀大麻哈魚同屬鮭科魚類的大麻哈魚屬，所以這些性別標(biāo)記在屬內(nèi)并不存在種系特異性；Felip等將虹鱒15個(gè)性別相關(guān)AFLP分子標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，并在虹鱒四個(gè)遺傳多態(tài)的雄性克隆系內(nèi)將其中一個(gè)Y染色體連鎖標(biāo)記Omy-163定位于性別位點(diǎn)附近[23]；Alfaqih等將虹鱒5個(gè)候選性別決定基因與Y染色體進(jìn)行了連鎖[8]，Brunelli等已經(jīng)成功獲得了虹鱒的Y染色體序列[28]。由此可見，虹鱒的性染色體已經(jīng)確定為Y染色體，而且已經(jīng)獲得了Y染色體的序列及多個(gè)性別相關(guān)的分子標(biāo)記和候選性別決定基因。本文作者根據(jù)已公布的虹鱒的OmyP9、Omy-163和GH2基因等性別標(biāo)記的序列設(shè)計(jì)了18對(duì)引物，采用SSCP技術(shù)篩選哲羅魚性別的分子標(biāo)記，未能發(fā)現(xiàn)哲羅魚雌雄差異。這可能是由于虹鱒和哲羅魚雖同屬鮭科，但不同屬，而性別標(biāo)記又存在屬間特異性，所以虹鱒的性別標(biāo)記不能應(yīng)用于哲羅魚。既然哲羅魚與虹鱒同屬鮭科魚類，在遺傳進(jìn)化方面存在許多共同之處，可以參考虹鱒性別方面的研究方法對(duì)哲羅魚性染色體及性別相關(guān)分子標(biāo)記進(jìn)行研究。

分析本研究未發(fā)現(xiàn)性別特異位點(diǎn)的可能原因有以下兩方面：①AFLP技術(shù)是針對(duì)于整個(gè)基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增，而與性別相關(guān)的基因數(shù)量較少，因此采用該技術(shù)尋找哲羅魚雌雄之間的差異存在一定的困難；②本研究所用的引物組合較少，樣本量也較少，所以擴(kuò)增出的多態(tài)性位點(diǎn)不是很多，若采用多種雌雄差異分析方法，或者選用更多的選擇性擴(kuò)增引物，改進(jìn)電泳條件，檢測更多的雌雄差異位點(diǎn)，將更有助于尋找到雌雄特異位點(diǎn)。另外，魚類的性別不僅與遺傳因素有關(guān)，還與環(huán)境因素有一定的關(guān)系，可以分為遺傳性別和生理性別，遺傳性別和生理性別的不統(tǒng)一也會(huì)造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的不準(zhǔn)確，在某些雌雄出現(xiàn)比例差異很大的位點(diǎn)上，如E2-PT3，雄性個(gè)體均有出現(xiàn)，而雌性個(gè)體只有3個(gè)出現(xiàn)，這3個(gè)個(gè)體有可能在生理上屬雌性，而在遺傳上屬雄性，因此用性別特異位點(diǎn)鑒定性別時(shí)，其準(zhǔn)確性并不能夠達(dá)到100%，即使獲得某個(gè)雌雄特異位點(diǎn)，擴(kuò)大樣本量分析時(shí)也不能保證其能夠完全鑒定出雌雄。

哲羅魚是我國的瀕危物種，同時(shí)也是一個(gè)優(yōu)良的淡水養(yǎng)殖品種。哲羅魚的雌雄從外形上很難分辨，因此開發(fā)哲羅魚性別的特異性標(biāo)記，對(duì)其進(jìn)行性別鑒定，可以對(duì)雌雄群體進(jìn)行不同性狀的定向選育，形成不同性狀的優(yōu)良品種；或分別對(duì)雌雄群體進(jìn)行雜交獲得具有雜種優(yōu)勢(shì)的后代。本文雖然沒有找到哲羅魚雌雄特異位點(diǎn)，但該研究積累的大量AFLP分析結(jié)果和數(shù)據(jù)，可作為哲羅魚的遺傳背景資料，為哲羅魚性別或其他方面的進(jìn)一步研究提供參考。

[1]徐偉,尹家勝,姜作發(fā),等.哲羅魚人工繁育技術(shù)的初步研究[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2003,10(1):26-30.

[2]關(guān)海紅,匡友誼,徐偉,等.哲羅魚消化系統(tǒng)器官發(fā)生發(fā)育的組織學(xué)觀察[J].動(dòng)物學(xué)雜志,2007,42(2):116-123.

[3]張永泉,尹家勝,賈鐘賀,等.哲羅魚胚胎和仔魚發(fā)育的研究[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,23(6):425-430.

[4]張榮華,孫中武,尹家勝,等.哲羅魚的染色體核型分析[J].水產(chǎn)學(xué)雜志,2008,21(1):64-67.

[5]梁利群,常玉梅,董崇智,等.微衛(wèi)星DNA標(biāo)記對(duì)烏蘇里江哲羅魚遺傳多樣性的分析[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2004,28(3):241-244.

[6]Tong G X,Kuang Y Y,Yin J S,et al.Isolation of microsatellite DNA and analysis on genetic diversity of endangered fish,Hucho taimen(Pallas)[J].Molecular Ecology Notes,2006,6(4):1099-1101.

[7]匡友誼,佟廣香,尹家勝,等.呼瑪河哲羅魚遺傳多樣性的AFLP分析[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2007,14(4):615-621.

[8]Alfaqih M A,Brunelli J P,Drew R E,et al.Mapping of five candidate sex-determining loci in rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)[J].BMC Genetics,2009,10:2.

[9]Woram R A,Gharbi K,Sakamoto T,et al.Comparative genome analysis of the primary sex-determining locus in salmonid Fishes[J].Genome Res,2003,13:272-280.

[10]Iturra P,Medrano J F,Bagley M,et al.Identification of sex chromosome molecular markers using RAPDs and fluorescent in situ hybridization in rainbow trout[J].Genetica,1998,101:209-213.

[11]Devlin R H,Biagi C A,Smailus D E.Genetic mapping of Y-chromosomal DNA markers in Pacific salmon[J].Genetica,2001,111:43-58.

[12]雷娜,李景富,李燁,等.番茄AFLP技術(shù)體系的優(yōu)化與建立[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39(3):29-33.

[13]岳志芹,王偉繼,孔杰,等.AFLP分子標(biāo)記構(gòu)建中國對(duì)蝦遺傳連鎖圖譜的初步研究[J].高技術(shù)通訊,2004(5):88-93.

[14]韓志強(qiáng),高天翔,王志勇,等.黃姑魚群體遺傳多樣性的AFLP分析[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2006,30(5):640-646.

[15]李文楓,李景富,許向陽,等.番茄抗葉霉病基因Cf-11的AFLP標(biāo)記[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39(9):25-28.

[16]王曉梅,宋文芹,劉松,等.利用AFLP技術(shù)篩選與銀杏性別相關(guān)的分子標(biāo)記[J].南開大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2001,34(1):5-9.

[17]Rahman M A,Ainsworth C C.AFLP Analysis of genome difference between male and females in dioecious plant rumex acetosa[J].Journal of Biological Sciences,2004,4(2):160-169.

[18]司偉.全雌鯉魚育種技術(shù)及性別相關(guān)分子標(biāo)記研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[19]楊東,余來寧,張繁榮,等.篩選與尼羅羅非魚性別相關(guān)的AFLP標(biāo)記[J].水生生物學(xué)報(bào),2007,31(6):901-904

[20]楊東.尼羅羅非魚性別決定機(jī)制和性別相關(guān)的分子標(biāo)記[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[21]馬洪雨,陳松林,李靜,等.半滑舌鰨雌性特異AFLP標(biāo)記CseF 783的克隆及其在遺傳性別鑒定中的應(yīng)用[J].遺傳,2009,31(1):88-94.

[22]Ma H Y,Chen S,LI J,et al.Cloning,characterization of two female-specific AFLP markers and development of PCR-based sex identification method for the halfsmooth tongue sole Cynoglossus semilaevis[J].Current Zoology,2009,55(4):309-314.

[23]Felip A,Young W P,Wheeler P A,et al.An AFLP based approach for the identification of sex linked markers in rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)[J].Aquaculture,2005,247(1-4):35-43.

[24]Artieria C G,Mitchella L A,Nga S H S,et al.Identification of the sex-determining locus of Atlantic salmon(Salmo salar)on chromosome 2[J].Cytogenet Genome Res,2006,112:152-159.

[25]佟廣香,魯翠云,匡友誼,等.哲羅魚基因組微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建與分析[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2006,13(2):181-186.

[26]佟廣香,包玉龍,尹家勝,等.哲羅魚AFLP技術(shù)體系建立的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,30(3):405-410.

[27]Iturra P,Lam N,Fuente M de la,et al.Characterization of sex chromosomes in rainbow trout and coho salmon using fluorescence in situ hybridization(FISH)[J].Genetica,2001,111:125-131.

[28]Brunelli J P,Wertzler K J,Sundin K,et al.Y-specific sequences and polymorphisms in rainbow trout and Chinook salmon[J].Genome 2008,51(9):739-748.