趙玉婷 徐世希 王勝峰 周彥彬 田 娟 冉黎靈 左 英 丁勁松*

中南大學(xué)藥學(xué)院（410013）

來曲唑是人工合成的第3代非甾體類高選擇性芳香化酶抑制劑[1]，通過與細(xì)胞色素P450芳香化酶中亞鐵血紅素的鐵原子結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)其活性位點(diǎn)并抑制該酶活性，從而減少雌激素的生物合成[2]。臨床上主要用于雌激素依賴性疾病，如婦女絕經(jīng)期乳腺癌[3]和不孕癥[4]的治療。目前，生物介質(zhì)中來曲唑的測(cè)定方法有高效液相色譜法（highperformance liquid chromatography，HPLC）[5,6]、酶免疫分析法[7]和高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]等。酶免疫分析法在分析過程中會(huì)生成很多交聯(lián)反應(yīng)代謝物影響其準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性；高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀器普及難度大，不適于多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用；HPLC法具有準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)來曲唑濃度的常用方法。本實(shí)驗(yàn)成功建立了測(cè)定人體血漿樣品中來曲唑濃度的HPLC-UV法，并通過比較分析來曲唑分散片和來曲唑片在健康受試者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，評(píng)價(jià)其相對(duì)生物利用度及二者的生物等效性，從而為來曲唑分散片的臨床合理用藥提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-2010C高效液相色譜儀；LC-Solution數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；TGL16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司） ；AB-265S型分析天平（日本梅特勒）；WH-2微量旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

來曲唑?qū)φ掌罚ū本┑卤娙f全藥物技術(shù)開發(fā)有限公司提供，批號(hào)：070322，含量：99.75%）；咪唑斯汀對(duì)照品（三九醫(yī)藥股份有限公司提供，批號(hào)：20070307，含量：99.6%）；磷酸二氫鉀（廣東汕頭市西隴化工廠，批號(hào)：060612），乙腈（色譜純，TEDIA）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純（AR級(jí)）；所有試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 貯備液的配制

來曲唑貯備液：精密稱取來曲唑?qū)φ掌?.04977g（相當(dāng)于來曲唑0.04965g）于50mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度（0.9929mg/mL）。置于-4℃冰箱中保存，使用時(shí)稀釋至所需濃度。

內(nèi)標(biāo)貯備液：精密稱取咪唑斯汀對(duì)照品0.01002g于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度（0.20mg/mL）。置于-4℃冰箱中保存，使用時(shí)稀釋至所需濃度（1.0μg/mL）。

1.3 色譜條件

色譜柱：迪馬 Diamonsil C18柱（4.6mm×200mm，5μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：乙腈∶磷酸二氫鉀溶液＝41∶59（v/v）；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：239nm。

1.4 血漿樣品處理

精密吸取血漿1.0mL，置10mL具塞尖底玻璃離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液（1.0μg/mL咪唑斯汀溶液）100μL，渦漩混勻，加入4mL乙醚，渦旋3min，2000r/min離心5min，轉(zhuǎn)移有機(jī)相至另一支干燥的10mL具塞尖底玻璃離心管中，40℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)昧鲃?dòng)相100μL復(fù)溶，進(jìn)樣20μL。

1.5 給藥與血樣采集

本試驗(yàn)經(jīng)中南大學(xué)藥學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。18名健康男性受試者，年齡為19～24歲，體質(zhì)量61～72kg，在簽署知情同意書并體檢合格后納入試驗(yàn)。受試者隨機(jī)分成兩組，禁食12h后，于次日晨分別空腹口服來曲唑分散片或來曲唑片2.5mg，在給藥前（0h）和給藥后0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2、4、8、12、24、48、96、144h 從肘靜脈取血5mL，3周后交叉服藥，取血方法和時(shí)間點(diǎn)同前1周期。采集的血樣標(biāo)本置于肝素化試管中，立即離心分離血漿，-20℃保存至測(cè)定。

1.6 藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

參數(shù)Tmax和Cmax為實(shí)測(cè)值，AUC0-t用梯形面積法計(jì)算，消除速率常數(shù)K和t1/2用血藥濃度-時(shí)間曲線尾端（消除相）數(shù)據(jù)直線回歸計(jì)算。AUC0-t、Cmax經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行藥物間、周期間、個(gè)體間的3個(gè)因素方差分析，再以雙向單側(cè)t檢驗(yàn)進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)，Tmax進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 色譜行為

在選定的色譜條件下，來曲唑與內(nèi)標(biāo)及血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)分離良好，來曲唑和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為6.8和8.0min，峰形良好?？瞻籽獫{、來曲唑和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品、空白血漿中加入來曲唑和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品、受試者服藥后血漿樣品的色譜圖見圖1。

圖1 空白血漿（A）、來曲唑（1，2000μg/L）和內(nèi)標(biāo)（2）對(duì)照品（B）、來曲唑（49.6μg/L）和內(nèi)標(biāo)加入空白血漿基質(zhì)中（C）和受試者口服受試制劑1.5h后的血漿樣本加入內(nèi)標(biāo)后色譜圖（36.36μg/L）（D）

2.2 線性范圍和定量下限

精密吸取空白血漿1.0mL，置10mL具塞尖底玻璃離心管中，分別加入來曲唑貯備液，配制成來曲唑濃度為2.48、3.10、6.20、12.40、24.80、49.60、99.20μg/L的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，渦旋1min，混勻，按“血漿樣品處理”項(xiàng)操作，記錄色譜圖。以測(cè)得的來曲唑峰面積A與內(nèi)標(biāo)峰面積Ai比值對(duì)來曲唑血藥濃度C（μg/L）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A/Ai＝0.0570×C+0.0925 （r=0.9994）。血漿中來曲唑濃度在2.48～99.2μg/L范圍內(nèi)與峰面積比線性關(guān)系良好，其最低定量濃度為2.48μg/L。

2.3 萃取回收率

配制濃度為2.48、6.20、12.40、49.6μg/L的來曲唑無水乙醇液和1.0μg//mL的咪唑斯汀甲醇液，每個(gè)濃度各制備5份作為對(duì)照品溶液，取20μL進(jìn)樣記錄色譜圖，得到對(duì)照溶液中來曲唑和內(nèi)標(biāo)的峰面積。另用空白血漿配制成來曲唑濃度為2.48、6.20、12.40、49.60μg/L和內(nèi)標(biāo)濃度為1.0μg/mL的血漿樣品各5份。按“1.4”項(xiàng)下處理，進(jìn)樣20μL記錄血漿樣品中來曲唑和內(nèi)標(biāo)的峰面積，以血漿樣品的峰面積除以同濃度的對(duì)照品峰面積所得的百分率計(jì)算萃取回收率。結(jié)果來曲唑4個(gè)濃度的萃取回收率分別為（90.55±12.26）%、（88.38±1.62）%、（88.82±8.65）%、（67.56±10.46）%（n=5）；內(nèi)標(biāo)萃取回收率為（81.42±6.38）%（n=5）。

2.4 方法回收率及精密度

配制來曲唑濃度為2.48、6.20、12.40、49.60μg/L的血漿樣品各5份，按“1.4”項(xiàng)下處理后進(jìn)樣，記錄來曲唑和內(nèi)標(biāo)峰面積，按回歸方程計(jì)算測(cè)得濃度，分別在1天內(nèi)測(cè)定5次，以測(cè)得值與加入值的比值計(jì)算方法回收率和日內(nèi)精密度。上述3組樣品連續(xù)測(cè)定3d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果方法回收率在87.88%～104.02%（n=20），日內(nèi)、日間RSD均＜10%。

2.5 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制來曲唑濃度為6.20、12.40、49.60μg/L的血漿樣品，室溫下放置8h、復(fù)溶后室溫下放置12h、反復(fù)凍融2次或凍存20d，檢驗(yàn)其穩(wěn)定性。結(jié)果在這4種情形下，來曲唑血漿樣品均處于穩(wěn)定狀態(tài)（RSD＜8.6%）。

2.6 方法學(xué)質(zhì)控

配制來曲唑濃度為6.20、12.40、49.60μg/L的血漿樣品，即質(zhì)控樣品（QC樣品），按“1.4”項(xiàng)下操作，20μL進(jìn)樣。低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品均勻分布在未知樣品測(cè)試順序中。本試驗(yàn)進(jìn)行了9次共27個(gè)QC樣品，結(jié)果QC樣品的測(cè)定值均落在靶值的87.7%～113.04%。

2.7 血樣測(cè)定和藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)

18例受試者口服來曲唑受試制劑或參比制劑后的0～144h平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2，受試試劑和參比制劑的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1。

圖2 18例男性健康志愿者單劑量口服受試制劑（T）或參比制劑（R）2.5 mg后平均血藥濃度-時(shí)間曲線

2.8 統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果

用梯形法（AUC0-t）估算受試制劑與參比制劑的相對(duì)生物利用度為（101.20±19.33）%。方差分析結(jié)果表明，二者主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0-144和AUC0-∞在制劑間和周期間均沒有顯著性差異（P＞0.05）；Cmax、AUC0-144、AUC0-∞比值的90%置信區(qū)間分別為95.1%～103.3%、90.5%～108.4%、84.7%～112.1%；兩制劑的Tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異（P＞0.05），根據(jù)以上結(jié)果判定兩制劑生物等效。

表1 18名健康受試者分別單劑量口服2.5mg來曲唑受試制劑或參比制劑后的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)（n=18，±SD）

表1 18名健康受試者分別單劑量口服2.5mg來曲唑受試制劑或參比制劑后的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)（n=18，±SD）

參數(shù) 來曲唑分散片（T） 來曲唑片（R）AUC0-144 [μg/(h·L)] 1662.65±300.94 1682.69±329.26 AUC0-∞ [μg/(h·L)] 2014.94±580.66 2063.84±571.17 Cmax (μg/L) 33.20±4.25 33.60±5.17 Tmax (h) 1.60±0.65 1.50±0.34 t1/2 (h) 70.61±21.21 66.82±18.26 F (%) 101.20±19.33

3 討 論

本文建立的測(cè)定來曲唑濃度的HPLC-UV法具有成本低、速度快、操作簡(jiǎn)便、敏感度高及準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。文獻(xiàn)采用C18柱液-固相萃取方法[9]，回收率提高，但成本增加，洗脫時(shí)間長(zhǎng)（大約20min）；本文以乙醚為萃取劑，操作簡(jiǎn)單、成本降低，萃取回收率高，保留時(shí)間僅為6.8min，耗時(shí)少。此方法的定量下限為2.48μg/L，方法回收率在87.88%～104.02%（n=20），日內(nèi)、日間RSD均＜10%，符合體內(nèi)藥物分析及藥動(dòng)學(xué)研究的要求。此外，本實(shí)驗(yàn)首次采用咪唑斯汀為內(nèi)標(biāo)，其色譜峰與來曲唑及內(nèi)源性物質(zhì)完全分離，保留時(shí)間為8min，穩(wěn)定性好，符合內(nèi)標(biāo)選擇的標(biāo)準(zhǔn)。

兩種制劑的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，來曲唑分散片的相對(duì)生物利用度為（101.20±19.33）%。兩制劑Cmax、AUC0-144和AUC0-∞沒有顯著性差異（P＞0.05），其比值的90%置信區(qū)間均符合生物制劑等效標(biāo)準(zhǔn)，Tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗(yàn)亦未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05），表明來曲唑分散片和來曲唑片具有生物等效性。

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