焦小麗 黃新蘭* 季紅蘭 陳琴華

江蘇省揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司（225321）

替硝唑注射液為抗厭氧菌及滅滴蟲藥，臨床主要用于治療滴蟲、腸及腸外阿米巴病、賈第蟲病和厭氧菌感染。替硝唑注射液在《中國藥典》2005 版中采用家兔法檢查熱原[1]，但家兔法操作繁瑣費(fèi)時(shí)，而且實(shí)驗(yàn)成本高，不適用于注射劑生產(chǎn)過程中的質(zhì)量監(jiān)控。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)鱟試劑在沒有干擾條件下可以對樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的原理，參照《中國藥典》2005 版中的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，采用凝膠法鱟試驗(yàn)法，通過干擾實(shí)驗(yàn)確立了替硝唑注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，并與家兔法進(jìn)行對照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法準(zhǔn)確可靠、操作方便簡單，可以用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替家兔法控制替硝唑注射液的熱原[2]。

1 儀器與試藥

2H-2型漩渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；TAL-3A型干式恒溫器（南京三愛斯技術(shù)開發(fā)有限公司）；LC-233B1型高溫干燥箱。細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（批號為150601-200862，120EU/支，中國藥品生物制品檢定所）。鱟試劑（TAL，批號為0810222，0.25EU/支，0.1mL/支，湛江安度斯生物有限公司；批號為0809200，0.25EU/支，0.1mL/支，湛江博康海洋生物有限公司）。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，批號為0806300，25mL/瓶，湛江安度斯生物有限公司）；熱原合格的替硝唑注射液（規(guī)格：200mL：0.8g，批號：08090611、08090811、08090911揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)南京海陵藥業(yè)有限公司）。

2 方法與結(jié)果[3-13]

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值L確定

公式L=K/M中L為細(xì)菌內(nèi)毒素限值；K為按規(guī)定的給藥途徑，人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑為5EU/(kgh)[1]；M為每小時(shí)內(nèi)每千克體質(zhì)量（人）的最大給藥劑量，或熱原檢查家兔按規(guī)定給藥途徑的給藥劑量，2005年版《中國藥典》規(guī)定家兔劑量為8mL/kg，因此可算得L=5/8=0.625EU/mL。

2.2 最大有效稀釋倍數(shù)的確定

根據(jù)公式MVD=cL/λ，L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，c為供試品溶液的濃度，λ為鱟試劑的標(biāo)示敏感度。2005年版《中國藥典》規(guī)定當(dāng)L以EU/mL表示時(shí)，c為1.0mL/mL。L=0.625EU/mL，λ為0.25EU/mL，則MVD=2.5。

2.3 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET）的質(zhì)量考察

實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（內(nèi)毒素含量＜0.015EU/mL）經(jīng)檢查，在37℃試管恒溫儀中放置4h未與鱟試劑產(chǎn)生凝聚反應(yīng)，符合中國藥典規(guī)定[2]。

2.4 TAL敏感度復(fù)核

所用TAL按2005年版《中國藥典》規(guī)定進(jìn)行敏感度復(fù)核。結(jié)果均在0.5～2λ，符合規(guī)定，故可用于細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。

2.5 干擾預(yù)試驗(yàn)

選用λ=0.25EU/mL的TAL，以原液作為基準(zhǔn)，用BET水對樣品進(jìn)行倍比稀釋，得樣品的稀釋倍數(shù)系列（即原液，1∶2、1∶4、1∶8、1∶16），以此系列為NC系列。PC系列：用原液和供試品各稀釋液將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成與上述NC系列相同的稀釋倍數(shù)系列，但在稀釋過程中每稀釋倍數(shù)中都會有2λ內(nèi)毒素。選擇兩個(gè)廠家的標(biāo)示量為0.25EU/mL的TAL，使之分別與上述兩個(gè)系列反應(yīng)，同時(shí)作陽性對照和陰性對照，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：樣品溶液稀釋倍數(shù)在1∶2以下時(shí)不干擾試驗(yàn)。

2.6 干擾試驗(yàn)

采用兩個(gè)廠家0.25EU/mL的TAL，用替硝唑液注射液的1∶2稀釋液和BET水將同一細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品分別制成2.0、1.0、0.5、0.25λ的系列濃度溶液，考察本品對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的干擾情況，結(jié)果見表2。Es值在0.5～2.0λ，且Et值在0.5Es～2.0Es，說明此時(shí)樣品稀釋對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾。

表1 供試品干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

表2 供試品的干擾試驗(yàn)結(jié)果

表3 3批替硝唑注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

2.7 樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

按2005年版《中國藥典（二部）》附錄規(guī)定的方法，對3批樣品按1∶2稀釋后，以λ為0.25EU/mL的TAL進(jìn)行常規(guī)的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，3批替硝唑注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素均小于0.5EU/mL，與熱原法結(jié)果一致。

3 討 論

本試驗(yàn)采用不同廠家的TAL對3個(gè)批號樣品進(jìn)行凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果符合2005年版《中國藥典》附錄有關(guān)規(guī)定，排除了采用了不同廠家TAL對本試驗(yàn)帶來的影響，且供試品用熱原檢查法檢測也均符合規(guī)定。因此，可認(rèn)為用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢測替硝唑注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素是可行的，并可確定其細(xì)菌內(nèi)毒素限值為0.5EU/mL。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M] .北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005：XIE86.

[2] 葉明,紀(jì)綠波.細(xì)菌內(nèi)毒素及其檢查法的研究[J] .廣東藥學(xué),2003,13(2)：28-29.

[3] 吳揚(yáng),趙云燕.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的應(yīng)用進(jìn)展[J] .安徽醫(yī)藥,2004,8(3)：226-227.

[4] 黃清泉,劉文英,丁黎.熱原及其檢查方法的研究進(jìn)展[J] .中國新醫(yī)藥,2004,2(2)：1-4.

[5] 楊忠思,吳振軍,杜濱.熱原和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查研究進(jìn)展[J] .醫(yī)學(xué)綜述,2005,11(2)：142-144.

[6] 司增銀,姜隆梅,于成軍,等.兔法與鱟試劑法檢測大輸液熱原控制標(biāo)準(zhǔn)探討[J] .泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1994,15(3)：170-171.

[7] 舒達(dá)利.鱟法檢查細(xì)菌內(nèi)毒素的實(shí)驗(yàn)探討[J] .中華實(shí)用中西醫(yī)雜志,2006,19(8)：967-968.

[8] 林彩,賀俊英,次旦扎西,等.替硝唑注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查[J] .中國新醫(yī)藥,2003,2(7)：35-36.

[9] 張永堅(jiān),馮聚錦.鱟試劑在藥品生產(chǎn)過程細(xì)菌內(nèi)毒素控制上的應(yīng)用[J] .醫(yī)藥工程設(shè)計(jì)雜志,2003,24(10)：11-14.

[10] 紀(jì)國力.凝膠法在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查中常見的干擾因素和處理[J] .社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志,2008,6(9)：84-85.

[11] 王欣放,王曉雷.凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查中的有關(guān)注意事項(xiàng)[J] .中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2007,4(36)：249.

[12] 林郁,焦志鐵,沈素琴.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法綜述[J] .時(shí)珍國醫(yī)國藥,2006,17(8)：1575-1576.

[13] 盈坤,房霞,雷光.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中應(yīng)注意的問題[J] .醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2006,25(11)：1217-1218.