孫 晶, 胡蓓蕾, 鄔 偉, 陳松芳, 尹 琳

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種常見(jiàn)的進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,以記憶和認(rèn)知障礙、人格改變等為特征。膽堿能系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān),其功能降低是導(dǎo)致 AD的主要原因。有研究表明隨著 AD病程的進(jìn)展,患者大腦皮質(zhì)和海馬的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性明顯下降,并且與癡呆的嚴(yán)重程度相關(guān)[1,2]。根據(jù) AD的病理機(jī)制,如果能提高 AD患者中樞膽堿能系統(tǒng)的功能,則有望改善 AD的病理狀態(tài),因此尋求改善中樞膽堿能系統(tǒng)功能的方法已成為 AD防治研究中的重要內(nèi)容之一。大豆異黃酮(soybean isoflavone,SIF)是存在于大豆及其制品的一種多酚化合物,是一類天然的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑,其獨(dú)特的保健、預(yù)防和治療慢性退行性疾病的作用己引起學(xué)術(shù)界廣泛的關(guān)注[3]。本研究通過(guò)雙側(cè)海馬注射 Aβ25-35建立 AD動(dòng)物模型,利用 Morris水迷宮及免疫組化法檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變及海馬 ChAT的表達(dá),來(lái)探討SIF對(duì) AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響的可能機(jī)制,為SIF作為神經(jīng)保護(hù)劑防治神經(jīng)退行性疾病的基礎(chǔ)理論研究和臨床實(shí)踐提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

1.1.1 試劑 大豆提取物(SIF含量 41.13%,天津尖峰天然產(chǎn)物公司);Aβ25-35(Sigma公司),用無(wú)菌生理鹽水將 Aβ25-35稀釋成 10μg/μl-1,37℃孵育1w,使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài);兔抗大鼠 ChAT多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);生物素標(biāo)記羊抗兔 IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);羧甲基纖維素鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 大鼠腦立體定位儀 SN-2(日本),Morris水迷宮及視頻分析軟件(上海吉量生物軟件有限公司)。

1.2 動(dòng)物與處理

1.2.1 動(dòng)物及飼養(yǎng) SPF級(jí)健康雄性 SD大鼠,體重 200～230g,由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)條件：溫度 20℃ ～23℃;濕度 5%～55%,自由飲水,飼以基礎(chǔ)飼料,12h/12h光/暗環(huán)境。

1.2.2 動(dòng)物分組與處理 用水迷宮篩選反映迅速、活躍的大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和 SIF組,每組 10只。SIF灌胃液用 0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配制,SIF干預(yù)劑量為 240mg/kg-1/d-1(前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)該劑量保護(hù)效果較好),對(duì)照組和模型組灌胃等量的 0.5%CMC-Na。連續(xù)灌胃 14d后,用 10%水合氯醛(3m l/kg-1)腹腔注射麻醉大鼠,參照大鼠腦立體定位圖譜,定位雙側(cè)海馬 CA1區(qū)(以前囟為原點(diǎn),向后 3.0mm,旁開(kāi) 2.2mm,顱骨表面下深度為 2.8mm),然后鉆開(kāi)顱骨,暴露硬腦膜,微量進(jìn)樣器自腦表面定位點(diǎn)垂直進(jìn)針,緩慢將聚集狀態(tài)Aβ25-351μl注入。注射時(shí)間 10min,留針 10min,使Aβ25-35充分浸潤(rùn)局部組織,皮膚切開(kāi)處給予少許青霉素粉劑,縫合切口,常規(guī)飼養(yǎng)。對(duì)照組手術(shù)方法相同,注射同體積的生理鹽水。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化的檢測(cè)-Morris水迷宮法 于術(shù)后 7d進(jìn)行 Morris水迷宮訓(xùn)練。Morris水迷宮由一直徑 130cm、高 50cm的圓形水池組成,水深 30cm。將水池分成 4個(gè)象限,將站臺(tái)固定置于第 2象限中央,浸沒(méi)于水下 2cm,水溫(25±1)℃。水池周圍貼有豐富的參照線索供大鼠用來(lái)定位平臺(tái)。迷宮上方裝有攝像頭,大鼠行程可被記錄下來(lái)。測(cè)試包括：(1)定位航行試驗(yàn),歷時(shí) 5d,每天分上、下午 2個(gè)時(shí)段;每個(gè)時(shí)段 4次,分別從 4個(gè)不同的標(biāo)記點(diǎn),將大鼠于象限邊緣 1/2弧度處頭朝池壁放入水中,記錄 2min內(nèi)尋找平臺(tái)所需時(shí)間(逃避潛伏期)。若大鼠入水后 2min內(nèi)未能找到平臺(tái),則將其置于平臺(tái)上并停留 10s,引導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶,逃避潛伏期記錄為 2min。每次訓(xùn)練間隔 60s。(2)空間探索試驗(yàn),定位航行試驗(yàn)結(jié)束后撤除平臺(tái),任選一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中,記錄 2min內(nèi)大鼠在各象限的游泳時(shí)間和跨越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。

1.3.2 大鼠海馬 ChAT表達(dá)的檢測(cè)-免疫組化法 在水迷宮測(cè)試結(jié)束后,斷頭處死大鼠,立即取腦組織放入中性福爾馬林中固定,常規(guī)石蠟包埋,以海馬為中心連續(xù)切片(厚 4μm),脫蠟至水和抗原修復(fù),將 30g/L-1過(guò)氧化氫甲醇溶液滴于玻片上,孵育5～10min以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;滴加 1∶200的稀釋兔抗 ChAT一抗,4℃過(guò)夜,加入生物素標(biāo)記的羊抗兔 IgG工作液室溫孵育 20min,鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物溶液室溫下孵育 20m in;DAB顯色,蘇木素復(fù)染。最后常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。ChAT陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色,每只大鼠取 10張切片進(jìn)行免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞的測(cè)定：400倍光鏡下每張切片計(jì)數(shù) 4個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞,總和除以 4作為該大鼠的陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 經(jīng)過(guò) 5d的訓(xùn)練,各組大鼠平均逃避潛伏期隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加而縮短,說(shuō)明各組大鼠在 5d的游泳訓(xùn)練期間學(xué)習(xí)尋找平臺(tái)的能力逐次提高,但其學(xué)習(xí)能力有很大差別。模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損,SIF對(duì)癡呆模型有一定程度的保護(hù)作用,Levene方差齊性檢驗(yàn)顯示潛伏期方差均不齊,故采用 Welch法方差分析,潛伏期結(jié)果 F=32.043,P=0.000,以 Dunnett's T3法進(jìn)一步對(duì)各組作兩兩比較。模型組的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng),與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01),大鼠軌跡圖多以邊緣式和隨機(jī)式為主;SIF組與其他各組的比較也具有顯著性差異(P＜0.05或 P＜0.01),大鼠軌跡圖多傾向于趨向型或直線型。

2.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示,模型組大鼠在目的象限的停留時(shí)間較對(duì)照組明顯縮短,穿越站臺(tái)所在位置的次數(shù)也明顯減少(P＜0.01)。與模型組比較,SIF組大鼠在目的象限的停留時(shí)間延長(zhǎng),準(zhǔn)確穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)增加(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡顯示,對(duì)照組運(yùn)動(dòng)軌跡較集中于原平臺(tái)所在象限,軌跡呈明顯的趨向式;模型組大鼠較多地繞池壁游泳,較少游向原平臺(tái)附近,活動(dòng)范圍大,軌跡呈隨機(jī)式;SIF組大鼠活動(dòng)范圍相對(duì)集中,且頻繁穿越原平臺(tái)所在位置,其軌跡呈趨向式。

2.3 SIF對(duì) AD模型大鼠腦內(nèi) ChAT表達(dá)的影響 結(jié)果顯示,對(duì)照組可見(jiàn)到大量的 ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元,呈棕色或棕黃色,細(xì)胞層次清晰,排列整齊、緊密;模型組與對(duì)照組比較,ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少(P＜0.01),細(xì)胞層次紊亂,排列稀疏、無(wú)序,胞體小,染色淡;與模型組比較,SIF組可見(jiàn)較多的ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元(P＜0.05),細(xì)胞層次較清晰,排列較整齊(見(jiàn)表2)。

表1 SIF對(duì)大鼠空間搜索試驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶的影響(±s,n=10)

表1 SIF對(duì)大鼠空間搜索試驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶的影響(±s,n=10)

與對(duì)照組比較*P＜0.01;與模型組比較△P＜0.05

組別 例數(shù) 大鼠目的象限活動(dòng)時(shí)間(s) 大鼠穿越站臺(tái)次數(shù)對(duì)照組模型組SIF組10 10 10 42.54±5.26 20.15±7.01*33.79±5.62△9.3±6.37 3.7±9.88*7.1±4.91△

表2 各組大鼠海馬ChAT免疫陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)(±s,n=10)

表2 各組大鼠海馬ChAT免疫陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)(±s,n=10)

與對(duì)照組比較*P＜0.01;與模型組比較△P＜0.05

組別 例數(shù) ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)(個(gè)/視野)對(duì)照組模型組SIF組10 10 10 40.12±6.29 15.84±4.18*28.73±4.86△

3 討 論

理想的 AD動(dòng)物模型是篩選抗 AD藥物的重要前提。Aβ是 AD主要病理改變老年斑的主要成分。Hardy[4]等提出的淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)認(rèn)為,Aβ在腦內(nèi)形成不可逆的沉積是 AD病理發(fā)生的早期關(guān)鍵性事件。研究發(fā)現(xiàn),聚集態(tài)的 Aβ具有更強(qiáng)的神經(jīng)毒性,腦內(nèi)注射 Aβ可使動(dòng)物產(chǎn)生與 AD相似的神經(jīng)行為障礙和記憶缺損癥狀[5]。故本研究采用海馬注射聚集態(tài)的 Aβ25-35模擬體內(nèi) Aβ的沉積,以此作為 AD模型。

Morris水迷宮測(cè)試法中的定位航行實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)大鼠平均逃避潛伏期來(lái)反映其獲取空間信息和學(xué)習(xí)的能力,而空間探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠跨越原平臺(tái)位置的次數(shù)可以判斷動(dòng)物記憶貯存能力及提取再現(xiàn)能力。本研究結(jié)果顯示,Aβ25-35腦內(nèi)注射能使大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低,表現(xiàn)為大鼠平均逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)、在目的象限的停留時(shí)間明顯縮短及穿越站臺(tái)所在位置的次數(shù)也明顯減少,提示造模成功。

AD患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽堿神經(jīng)功能明顯下降,并且其臨床癥狀的嚴(yán)重程度和膽堿能系統(tǒng)的活性密切相關(guān),這也是膽堿能假說(shuō)的核心所在[6]。ChAT在膽堿能神經(jīng)元胞體內(nèi)合成,與 Ach的分布幾乎平行,故常作為研究膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志或估計(jì) Ach含量的間接指標(biāo)[7]。本研究結(jié)果顯示,大鼠海馬內(nèi)注射 Aβ25-35,海馬內(nèi) ChAT免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量減少、神經(jīng)元著色變淺,提示 Aβ的神經(jīng)毒性損傷了膽堿能神經(jīng)元,造成中樞膽堿能系統(tǒng)功能低下,ChAT活性降低,Ach在腦中的合成下降,代謝轉(zhuǎn)換率減慢,從而引起學(xué)習(xí)記憶功能下降。

SIF是一類具有廣泛營(yíng)養(yǎng)學(xué)價(jià)值、有健康保護(hù)和治療學(xué)意義的非固醇類物質(zhì),稱為植物雌激素。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),植物雌激素同雌激素一樣,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有著重要的作用。兩者都能延緩神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,起到神經(jīng)保護(hù)作用。植物雌激素能增加去卵巢大鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元 ChAT的表達(dá),改善去卵巢大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,提示對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變具有保護(hù)作用[8,9]。本研究結(jié)果顯示,SIF組海馬內(nèi) ChAT免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加,同時(shí)發(fā)現(xiàn)大鼠的空間記憶能力也明顯增強(qiáng),提示SIF改善學(xué)習(xí)記憶能力可能與改善膽堿遞質(zhì)合成有關(guān),但其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究探討。

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