郭繼東, 王 月, 信 宏

目前關(guān)于臨床上治療缺血性腦卒中的方法有早期溶栓、保護(hù)腦細(xì)胞及抗血小板聚集等方法,有效的治療措施只有極早期的溶栓治療,但是很少有患者受益。近年發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMCs)可以分化為神經(jīng)細(xì)胞[1],使其成為治療缺血性腦卒中研究的熱點(diǎn)。關(guān)于其機(jī)制的研究較多的集中于各類生長(zhǎng)因子及營(yíng)養(yǎng)因子,而對(duì)于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)方面未見(jiàn)報(bào)道。故本研究欲觀察 BMCs移植對(duì)缺血性腦卒中大鼠的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)的影響。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 健康幼年Wistar大鼠 5只,體重(120±10)g,用于提取 BMCs;健康成年Wistar大鼠 30只,體重(300±10)g,用于制作缺血性腦卒中模型。所有大鼠均雌雄不限,且由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自 Sigma公司,大鼠腦立體定位儀購(gòu)自北京智鼠多寶公司;ERK免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠 MSCs的分離、培養(yǎng)及收集 聯(lián)合采用密度梯度離心及貼壁法分離培養(yǎng)大鼠 MSCs,原代培養(yǎng)達(dá) 80%以上融合后按 1∶3傳代培養(yǎng),選取生長(zhǎng)良好的 1、2、3代細(xì)胞,用 0.25%胰蛋白酶室溫消化 5m in,用含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化,PBS清洗,1000r/min離心,每次 5min,共離心 3次,然后收集培養(yǎng)的大鼠 MSCs用于移植。

1.2.2 大鼠分組及缺血性腦卒中模型制作 30只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和 BMCs移植組,每組10只。采用Longa[2]方法制作大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。麻醉清醒后 2h采用Longa[2]的評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)分。0分和 4分的動(dòng)物棄之不用。假手術(shù)組只行開顱術(shù),不凝閉大腦中動(dòng)脈。

1.2.3 MSCs的移植 于造模術(shù)后 1w行細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)。在腦梗死側(cè)(右側(cè))殼核區(qū)于立體定向儀定位下進(jìn)行直接注射移植。移植組注射MSCs懸液 5μl,其他兩組大鼠于相同部位注射同等量不含細(xì)胞的0.1mol/L PBS。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 神經(jīng)功能損傷程度評(píng)分(NSS) 分別于造模前、移植前及移植后第 4周對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行NSS,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考Chen等[3]方法,主要觀察運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)功能、平衡能力及生理反射能力;總分為 18分,正常為 0分,分值越高其神經(jīng)損害程度越嚴(yán)重。

1.3.2 免疫組化染色 移植后第4周,每組取5只處死大鼠取腦組織。腦組織用生理鹽水和多聚甲醛先后經(jīng)心灌注固定,石蠟包埋,冠狀切片。嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行腦組織免疫組化染色檢測(cè)ERK蛋白表達(dá)。顯微鏡下任選 5個(gè) 400倍視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3.3 腦梗死體積檢測(cè) 移植后第 4周,各組剩余大鼠處死,取腦,于 -20℃冷凍 20min,冠狀切片,由前到后,共 5張切片,置 2%TTC液中,37℃避光孵育 30m in,梗死區(qū)不著色,正常腦組織染成紅色,隨即采用 40g/L甲醛固定,根據(jù)蒼白區(qū)觀察梗死灶范圍,依據(jù)公式計(jì)算梗死面積[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用 SPSS 13.0進(jìn)行方差分析和 t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量統(tǒng)計(jì) 假手術(shù)組無(wú)動(dòng)物缺失,模型組因麻醉過(guò)量死亡 2只,BMCs移植組因術(shù)后感染死亡 1只,其余大鼠均進(jìn)入結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

2.2 各組動(dòng)物NSS 造模前各組動(dòng)物 NSS比較無(wú)顯著差異(P＞0.05);移植前,模型組及移植組 NSS評(píng)分均較假手術(shù)組增高明顯(P＜0.05),但兩組間無(wú)顯著差異(P＞0.05);移植后,模型組最高,其次為移植組,最低者為假手術(shù)組,3組間均有顯著差異(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 各組 NSS比較

2.3 免疫組化 假手術(shù)組ERK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為 13.42±6.91,明顯低于模型組(120.33±30.52)和 BMCs移植組(35.85±12.64)(P＜0.05),BMCs移植組明顯高于模型組(P＜0.05)。

2.4 腦梗死體積 假手術(shù)組未見(jiàn)梗死灶,模型組梗死體積為(53.27±20.64)mm3;BMCs移植組梗死體積為(30.31±12.95)mm3,二者差異顯著(P＜0.05)。

3 討 論

成年哺乳動(dòng)物的神經(jīng)細(xì)胞缺乏再生能力,其損傷后很難恢復(fù),故缺血性腦卒中后如果不能在第一時(shí)間改善其血供,將導(dǎo)致缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的死亡。干細(xì)胞移植是近年醫(yī)學(xué)上乃至生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。但是胚胎干細(xì)胞移植存在倫理、法律及取材等方面的不便,故移植治療的應(yīng)用方面受到很大限制。BMCs是多能細(xì)胞,具有多項(xiàng)分化的潛能,在一定誘導(dǎo)條件下可分化為多種造血外組織,特別是中胚層和神經(jīng)外胚層發(fā)育來(lái)源的組織細(xì)胞,如成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等[5,6]。尤其是神經(jīng)元的分化方向,使其具有了強(qiáng)大的吸引力,很多研究者都嘗試將其用于治療各類神經(jīng)疾病,尤其用于治療缺血性腦卒中的研究近年更為廣泛。研究人員考慮到 BMCs具有高度可塑性,且取材方便、免疫排斥反應(yīng)弱,少受倫理學(xué)制約,移植方便等特點(diǎn),將其應(yīng)用于腦梗死的治療。

本研究成功地將 BMCs移植入梗死灶,結(jié)果表明,模型大鼠的神經(jīng)功能缺損得到明顯改善,其梗死的大腦面積也明顯減小,考慮與BMCs分化為神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān),同時(shí)我們未觀察到 BMCs移植對(duì)腦組織結(jié)構(gòu)的損傷。BMCs移植的療效顯著。

腦缺血時(shí)組織低氧缺氧,細(xì)胞可以表現(xiàn)為壞死或凋亡,同時(shí)細(xì)胞也會(huì)啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制對(duì)其缺氧損傷進(jìn)行修復(fù)。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)途徑是與細(xì)胞增殖,分化及凋亡控制密切相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑,ERK作為 MAPK的家族成員之一,可以介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化并促進(jìn)細(xì)胞的存活。正常生理?xiàng)l件下 ERKs就存在于動(dòng)物腦內(nèi),可被神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)和生長(zhǎng)因子等多種信號(hào)激活,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可通過(guò)基因表達(dá)、蛋白合成等影響神經(jīng)細(xì)胞增殖分化、突觸可塑性、軸突生長(zhǎng)等,并且參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過(guò)程[7]。但是關(guān)于 ERK在缺血性腦卒中的發(fā)病過(guò)程中到底起到保護(hù)還是損傷作用各家說(shuō)法不一[8～10]。

本研究結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)造模以后,大鼠腦組織中 ERK明顯增多,說(shuō)明ERK通過(guò)介導(dǎo)炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)缺血缺氧時(shí)的神經(jīng)細(xì)胞的死亡與凋亡[11]。但是移植入BMCs后,檢測(cè)結(jié)果顯示,大鼠腦內(nèi) ERK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少,表明BMCs的移植抑制了 ERK通路活性,下調(diào) ERK蛋白的表達(dá),保護(hù)缺血缺氧的神經(jīng)細(xì)胞免受炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的損傷,保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的功能,從而達(dá)到治療缺血性腦卒中的目的。

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