王蘇平, 趙 紅, 王得新, 張擁波, 高曉玉

腦白質(zhì)損傷越來越受到人們的關(guān)注。軸突、少突膠質(zhì)細(xì)胞及由少突膠質(zhì)細(xì)胞形成的髓鞘是中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)的重要成份。與神經(jīng)元類似,少突膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于損傷也極為敏感,可導(dǎo)致髓鞘的脫失和變性[1]。臨床上許多疾病,如多發(fā)性硬化和腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良等都與脫髓鞘損傷相關(guān)。

少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)廣泛存在于腦白質(zhì)和灰質(zhì),這類細(xì)胞在脫髓鞘損傷后能分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞并參與新髓鞘的形成[2],研究者希望通過刺激更多的這類細(xì)胞的增殖來完成髓鞘修復(fù),了解控制少突膠質(zhì)細(xì)胞階段性分化的分子機(jī)制至關(guān)重要。堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子 Olig1于 2000年首先被克隆,并證實(shí)其在少突膠質(zhì)細(xì)胞的成熟和髓鞘再生中發(fā)揮重要的作用[3～5]。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)地觀察了大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)2h后再灌注大鼠 Olig1在腦內(nèi)的分布及不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化,結(jié)合髓鞘的損傷進(jìn)一步探討 Olig1在腦缺血后髓鞘修復(fù)中的作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物的分組和MCAO模型制備 雄性 SD大鼠由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體重 280～320g。隨機(jī)分成 6組,分別是正常對(duì)照組和缺血2h再灌注 1d、3d、7d、14d和 28d組。每組 12只 ,其中 4只用于免疫組織化學(xué)分析;8只用于 Western blot蛋白檢測(cè)。采用 Nagasawa[6]方法,改良線栓法制成 MCAO模型。大鼠用 10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300mg/kg),仰臥位固定,經(jīng)頸部正中切開皮膚暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈顱外段,結(jié)扎頸外動(dòng)脈主干,分離頸內(nèi)動(dòng)脈的翼腭動(dòng)脈分支,在頸外動(dòng)脈近頸總動(dòng)脈分叉處剪一切口,將線栓向頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)方向插入 17～20mm,遇阻力時(shí)停止,栓子頭端即達(dá)大腦中動(dòng)脈起始部并進(jìn)入大腦前動(dòng)脈,將大腦中動(dòng)脈起始部和頸內(nèi)動(dòng)脈末端同時(shí)堵塞,阻斷大腦中動(dòng)脈的血流導(dǎo)致腦缺血,結(jié)扎入口處固定線栓。術(shù)后大鼠不能直行、向缺血對(duì)側(cè)劃圈爬行或傾倒、提尾懸空時(shí)患側(cè)前肢屈曲內(nèi)收,提示腦缺血制作成功;2h后直接拔出線栓恢復(fù)血流,實(shí)現(xiàn)再灌注。

1.2 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn) 再灌注后 1d、3d、7d、14d和 28d,動(dòng)物經(jīng) 10%水合氯醛 (300mg/kg/ip)麻醉后,打開胸腔,行左心室灌流。取出腦組織,放于恒冷切片機(jī)中做連續(xù)切片,切片厚度 20μm。腦片經(jīng)水化、滅活內(nèi)源性過氧化氫酶、封閉,加入Olig1單克隆抗體(Chem icon公司,MAB5540)1∶400過夜后,依次加入生物素標(biāo)記的二抗(SP9002,北京中杉)、辣根過氧化酶標(biāo)記鏈酶卵白素(SP9002,北京中杉),之后 3,3'聯(lián)苯二胺(DAB)顯色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,封片后顯微鏡下照相。

1.3 蛋白質(zhì)電泳檢測(cè) 各組大鼠于再灌注后按上述時(shí)間點(diǎn)斷頭,取出雙側(cè)紋狀體組織,每組組織中加入 0.5m l組織裂解液(50mmol/L-1Tris-HCl,40mmol/L-1NaF,2mmol/L-1EDTA,1mmol/L-1DTT),勻漿器研磨,取上清,按勻漿液∶氯仿∶乙醇 1∶1∶1的比例加入氯仿和乙醇,12,000g離心,棄去上下層液體,中間層膜狀固體置于 4℃冷風(fēng)吹干。加入 2%SDS 120μl,煮沸 10min,溶解蛋白。按照 BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。每一樣品按總蛋白 90μg,根據(jù)濃度計(jì)算出體積,加入上樣緩沖液,100℃煮沸5min。行 10%SDS-PAGE凝膠電泳,恒壓轉(zhuǎn)膜100V 60min,5%脫脂奶粉封閉 1h,Olig1單克隆抗體(Chemicon公司,MAB5540)1∶4000或 MBP多克隆抗體(Chemicon公司)1∶1000 4℃過夜。TBST洗膜,羊抗小鼠 IgG或羊抗兔 IgG二抗室溫孵育 1h,ECL發(fā)光液顯示后,暗室曝光于 X膠片上。

1.4 圖像分析 免疫組化圖像采集應(yīng)用 Spot Advanced軟件,選取缺血側(cè)紋狀體寬 1400μm和長(zhǎng)1200μm的區(qū)域,采用 Metamorph軟件計(jì)數(shù)再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)缺血側(cè)紋狀體區(qū)域 Olig1的陽性細(xì)胞數(shù)。每只大鼠選取 6張切片,計(jì)算出每張切片 Olig1的陽性細(xì)胞總數(shù),將 6張切片累加求其平均。每個(gè)時(shí)間點(diǎn) 4只動(dòng)物。Western blot圖像資料采用 Scanwizard 5.0掃描系統(tǒng),條帶光密度分析使用 TotalLab 1.0軟件。β-actin為內(nèi)參照,以 Olig1或 MBP光密度掃描值與相應(yīng)的 β-actin光密度掃描值的比值表示腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)Olig1或 MBP蛋白的變化,再以各不同時(shí)間點(diǎn) Olig1或 MBP蛋白質(zhì)的變化與正常對(duì)照組相比[7]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用 Prism 4.0軟件,多組數(shù)據(jù)間差異用單因素方差分析(one way ANOVA)并繼之以 Dunnett's post-hoc檢驗(yàn)。結(jié)果用平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,P＜0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 正常和腦缺血大鼠 Olig1的表達(dá)變化圖1顯示正常和腦缺血模型大鼠 Olig1的免疫組化染色。Olig1免疫陽性細(xì)胞廣泛分布于腦白質(zhì)和灰質(zhì),如皮層、胼胝體和紋狀體等區(qū)域。正常腦組織中,Olig1陽性細(xì)胞主要位于少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞漿。腦缺血后,損傷區(qū)域周邊胞核表達(dá)的 Olig1明顯增多(見圖1)。這提示腦缺血損傷后,Olig1由胞漿移至胞核。我們對(duì) MCAO大鼠腦缺血后不同時(shí)間點(diǎn) Olig1的陽性表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞分析計(jì)數(shù)(見表1),結(jié)果顯示腦缺血再灌注后的 1d至 3d Olig1陽性細(xì)胞數(shù)下降,7d回到正常水平,并維持此水平至缺血后的 28d。

表1 MCAO大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)缺血側(cè)紋狀體區(qū)域 Olig1陽性細(xì)胞數(shù)(±s)

表1 MCAO大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)缺血側(cè)紋狀體區(qū)域 Olig1陽性細(xì)胞數(shù)(±s)

與正常對(duì)照組相比*P＜0.05,**P＜0.01

再灌注時(shí)間 Olig1陽性細(xì)胞數(shù)/平方毫米對(duì)照組MCAO 1d MCAO 3d MCAO 7d MCAO 14d MCAO 28d 402.5±17.79 271.5±24.99**315±19.14*339.5±20.53 344±21.07 338.5±14.93

2.2 腦缺血后 Olig1和 MBP的蛋白表達(dá)變化Western Blot方法檢測(cè)缺血側(cè)紋狀體區(qū)域 Olig1的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,腦缺血后的 1d,Olig1蛋白表達(dá)明顯降低;3d回到接近正常水平,并維持此水平直至缺血后的 28d(見圖2)。然而,對(duì)側(cè)紋狀體中Olig1的蛋白表達(dá)未發(fā)生改變。這提示 Olig1蛋白表達(dá)水平的改變和損傷相關(guān)。堿性髓鞘蛋白(myelin basic protein,MBP)作為髓鞘的組成成分,用作髓鞘的標(biāo)志物[8]。為了檢測(cè)大鼠腦缺血后白質(zhì)的損傷程度,我們觀察了腦缺血后 1d、3d、7d、14d和 28d缺血側(cè)紋狀體區(qū)域 MBP的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,MBP的蛋白表達(dá)在腦缺血后 1～28d持續(xù)下降(見圖3)。這一結(jié)果提示腦缺血后髓鞘損傷發(fā)生較早,并持續(xù)進(jìn)展。

圖1 正常和 MCAO大鼠 Olig1免疫組化染色,缺血側(cè)紋狀體區(qū)域。 Scale bar=10μm

圖2 MCAO大鼠缺血側(cè)紋狀體區(qū)域 Olig1的蛋白表達(dá)情況,actin為上樣量的內(nèi)參照,與正常對(duì)照組相比**P＜0.01

圖3 Western Blot檢測(cè) MCAO大鼠缺血側(cè)紋狀體 MBP的蛋白表達(dá)情況,actin為上樣量的內(nèi)參照,與正常對(duì)照組相比*P＜0.05,**P＜0.01

3 討 論

少突膠質(zhì)細(xì)胞形成的髓鞘是白質(zhì)的重要成分,其髓鞘形成的過程由轉(zhuǎn)錄因子 Olig1調(diào)控[9,10]。MBP是髓鞘的組成成分之一,用于檢測(cè)髓鞘損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)對(duì) MCAO模型中 Olig1和 MBP的表達(dá)變化進(jìn)行了系統(tǒng)研究,并就兩者之間的關(guān)系進(jìn)行探討。

正常大鼠 Olig1陽性表達(dá)的細(xì)胞廣泛分布于腦白質(zhì)和灰質(zhì)(大腦皮層、胼胝體和紋狀體),典型地沿著髓鞘區(qū)域呈束狀排列。Olig1陽性染色主要位于少突膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿。這與文獻(xiàn)中的報(bào)道相吻合[3,4]。另外,我們發(fā)現(xiàn)紋狀體區(qū)域有少數(shù)的 Olig1位于細(xì)胞核中。根據(jù) Olig1在不同發(fā)育時(shí)期的亞細(xì)胞定位,Olig1位于 OPCs的細(xì)胞核中,出生后 2w移至少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞漿,并持續(xù)存在于胞漿中。脫髓鞘損傷發(fā)生時(shí),上述定位再次出現(xiàn),Olig1被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中[5]。我們推測(cè)少數(shù) Olig1的胞核定位的細(xì)胞是少突膠質(zhì)的前體細(xì)胞,這符合 OPCs正常情況下即在腦組織中存在,且占膠質(zhì)群體的 5%～8%[11]。腦缺血后,缺血側(cè)紋狀體區(qū)域胞核定位的Olig1明顯增加,未缺血側(cè)未發(fā)現(xiàn)此種改變。可見MCAO模型中 Olig1的細(xì)胞內(nèi)定位發(fā)生了改變,由胞漿移至胞核,且發(fā)生改變的 Olig1僅位于缺血側(cè)。Olig1的胞核定位具有高度的部位損傷特異性,即損傷相關(guān)區(qū)域的 Olig1發(fā)生了核轉(zhuǎn)位[5]。胞核定位的Olig1對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子活性的啟動(dòng)至關(guān)重要,推測(cè)Olig1由胞核到胞漿的動(dòng)態(tài)再分布有助于 OPCs成熟為成髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞。

本次實(shí)驗(yàn)對(duì) MCAO模型再灌注后各時(shí)間點(diǎn)缺血側(cè)紋狀體中 Olig1免疫陽性細(xì)胞進(jìn)行了觀察。形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示,再灌注后 1d和 3d,Olig1的表達(dá)明顯減少,7d恢復(fù)到接近正常水平,并維持此水平直到缺血后的 28d。Western blot方法檢測(cè) Olig1的蛋白表達(dá)變化與免疫組化結(jié)果呈現(xiàn)一致的趨勢(shì)。

Olig1的表達(dá)在缺血再灌注后的 1d顯著降低,其具體機(jī)制是復(fù)雜而多樣的。Olig1主要在少突膠質(zhì)及其前體細(xì)胞中表達(dá),少突膠質(zhì)細(xì)胞具有缺血易損性,缺血早期即發(fā)生死亡,推測(cè)少突膠質(zhì)及其前體細(xì)胞的死亡是 Olig1下降的主要原因,當(dāng)然也不能排除 Olig1轉(zhuǎn)錄水平的下降對(duì)其的影響[12]。Olig1的表達(dá)在缺血后的 3d至 28d恢復(fù)到接近正常水平,可能是由于 OPCs遷移到損傷的部位,發(fā)生增殖、激活,彌補(bǔ)了少突膠質(zhì)細(xì)胞的死亡[2]。

MBP用作髓鞘的標(biāo)志物[8],Western blot結(jié)果顯示,MBP在腦缺血后的 1d至 28d逐漸下降,28d達(dá)到最低點(diǎn)。這反應(yīng)了髓鞘的脫失和破壞發(fā)生在缺血的早期,并隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸加重。有實(shí)驗(yàn)表明缺血后髓鞘脫失、排列方向紊亂、神經(jīng)纖維間空洞形成以及染色強(qiáng)度下降,同時(shí)軸突也發(fā)生類似的改變,這種改變進(jìn)行性加重直到損傷后的 21d[13]。髓鞘染色的變化和此次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的 MBP蛋白表達(dá)結(jié)果相吻合。缺血時(shí)軸突也同時(shí)受累,神經(jīng)元軸突和少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷之間存在因果關(guān)系。少突膠質(zhì)細(xì)胞缺血性損傷導(dǎo)致脫髓鞘病變,并使髓鞘包繞的軸突出現(xiàn)嚴(yán)重功能障礙。Olig1參與脫髓鞘損傷后的修復(fù)是在 2004年由 Arnett等人[5]首次發(fā)現(xiàn),可否通過 Olig1來治療脫髓鞘損傷性疾病一直處于探索之中。Olig1是髓鞘特異性蛋白的主要調(diào)節(jié)者,實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn) Olig1的表達(dá)和MBP的表達(dá)并不完全平行：Olig1在腦缺血后的 3d～28d恢復(fù)到正常水平,而 MBP的表達(dá)在腦缺血后持續(xù)下降,推測(cè)病理狀態(tài)下正常量的 Olig1對(duì)于髓鞘修復(fù)是不足夠的,進(jìn)一步的研究顯示上調(diào) Olig1的表達(dá)可以促進(jìn)髓鞘修復(fù)[14,15],其次 OPCs蓄積不足和受損髓鞘的殘骸未能被及時(shí)清除也對(duì)髓鞘的再生有抑制性的影響[16]。

髓鞘的修復(fù)是由脫髓鞘軸突釋放的信號(hào)啟動(dòng)的,其再生的過程依賴于 OPCs的蓄積、分化以及與脫髓鞘軸突間的相互作用。雖然體內(nèi)存在內(nèi)源性的髓鞘再生機(jī)制,但多數(shù)情況下髓鞘修復(fù)不能進(jìn)行,推測(cè)與多種因素有關(guān),如控制少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子間的平衡被打破(失調(diào)節(jié)假說)、環(huán)境因素和細(xì)胞表面抑制性分子的表達(dá)等。Olig1對(duì)于 OPCs的分化和髓鞘形成是至關(guān)重要的,了解損傷后 Olig1的變化規(guī)律并進(jìn)行干預(yù)治療,將為脫髓鞘損傷性疾病的治療提供理論依據(jù)?？煞裢ㄟ^ OPCs的移植、上調(diào) Olig1基因和增加 Olig1的核移位來促進(jìn)髓鞘的修復(fù)還不是很清楚,仍需進(jìn)一步探索。

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