宋大勇, 岳 武, 魏 盾, 林述凱, 孫 超, 李建華

聲動(dòng)力化學(xué)療法(sonodynamic therpy,SDT)可引起體外大鼠 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[1],為進(jìn)一步觀察 SDT對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響及是否有抗血管因素參與,我們以大鼠顱內(nèi) C6膠質(zhì)瘤為模型,研究了 SDT處理后大鼠腦膠質(zhì)瘤的細(xì)胞凋亡與微血管蛋白表達(dá)的變化。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 大鼠 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)外科研究所)、Wistar大鼠(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)、HMME(北京英發(fā)康美技術(shù)開發(fā)有限公司)、胎牛血清(天津 TBD公司)、RPMI-1640培養(yǎng)液 (美國(guó) Hylone公司)、胰蛋白酶(美國(guó) AMRESCO公司)、TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(寶靈曼公司)、兔抗鼠 VEGF、CD34免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、山羊抗兔IgG免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物制品有限公司)、SABC試劑盒通用型(Zymed公司)、DAB顯色劑(北京中杉金橋生物制品有限公司)。

1.2 儀器 US天使多功能治療儀(天使科技控股有限公司)、大鼠腦立體定向儀(上海江灣Ⅱ型)、MIR機(jī)(日本東芝公司 1.5TVISRT型)、倒置相差顯微鏡(日本 OLYMPUS公司 IX70型)、CO2培養(yǎng)箱(上海 Heraeus公司 BB5060型)、潔凈操作臺(tái)(上海力申科學(xué)儀器有限公司 H fsate1200型)、離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠 80-2B型)。

1.3 方法

1.3.1 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng) C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于含 10%胎牛血清的 RPMI-1640完全培養(yǎng)液25ml培養(yǎng)瓶中,將培養(yǎng)瓶置于 37℃、5%CO2和 95%空氣的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 大鼠 C6腦膠質(zhì)瘤模型的制作 Wistar大鼠(雄性,體重 250～350g)96只。術(shù)前 12h禁食、禁水,1%戊巴比妥鈉按 40mg/kg腹腔注射麻醉后,固定于江灣Ⅱ型立體定向儀上,常規(guī)方法制作大鼠顱內(nèi) C6腦膠質(zhì)瘤模型[2]。術(shù)后連續(xù) 3d注射青霉素 4萬 U/d,常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 大鼠接種 C6膠質(zhì)瘤術(shù)后14d,經(jīng) MIR掃描,待腫瘤直徑達(dá) 3～5mm隨機(jī)分成4組 ：(A)SDT組,即 US加 HMME組;(B)單純超聲(US)組;(C)單用血啉甲醚(HMME)組;(D)未處理的對(duì)照組。每組 24只。

1.3.4 SDT處理 1%戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg)后,A、C組大鼠尾靜脈注射 HMME(10mg/kg),2h后 A、B組行 US照射(頻率：1.0mHz,聲強(qiáng)度：0.5W/cm2,時(shí)間：120s)。處理后的大鼠避光 7d,常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 一般狀態(tài) 切口愈合情況、活動(dòng)能力、體重變化、有無偏癱、抽搐等神經(jīng)功能缺失癥狀。

1.4.2 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè) 4組大鼠處理后24h、3d,7d分別隨機(jī)處死 8只,開顱取出腫瘤組織。標(biāo)本常規(guī)固定、包埋、切片。TUNNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,方法按照 Roche公司原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作,常規(guī)封片,顯微鏡下觀察。以核陽性為判定標(biāo)準(zhǔn),并結(jié)合 HE染色 40倍顯微鏡下觀察,對(duì) HE染色證實(shí)為壞死的細(xì)胞不記數(shù)。細(xì)胞核內(nèi)有棕褐色染色者為陽性細(xì)胞,400倍顯微鏡下每張切片隨機(jī)選擇 5個(gè)視野,兩人雙盲計(jì)數(shù) 500個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù),取均值。排除有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和壞死灶的區(qū)域,因?yàn)檫@給單個(gè)凋亡細(xì)胞的鑒別帶來困難。計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率：凋亡細(xì)胞百分率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/(陽性細(xì)胞數(shù)+陰性細(xì)胞數(shù))×100%。

1.4.3 VEGF蛋白、CD34蛋白表達(dá)水平觀察4組大鼠治療 24h、3d、7d后,分別隨機(jī)處死 8只,開顱取出腫瘤組織。標(biāo)本常規(guī)固定、包埋、切片。標(biāo)本免疫組織化學(xué)染色采用 SABC法,按說明書進(jìn)行操作。因 CD34蛋白主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞,在間質(zhì)和癌巢都有分布,MV形態(tài)表現(xiàn)為管狀、線狀和點(diǎn)狀,以一個(gè)或一組內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記為一條血管,故通過測(cè)定 CD34蛋白表達(dá)可判定 MVD結(jié)果：先在 40倍光鏡下掃視腫瘤區(qū)域,選擇血管豐富的區(qū)域,轉(zhuǎn)400倍顯微鏡下觀察,隨機(jī)選擇 5個(gè)視野,記數(shù)被抗CD34抗體染成棕色的 MV數(shù)目,取均值作為該例的MVD值。VEGF蛋白表達(dá)結(jié)果判定：先在 40倍光鏡下掃視腫瘤區(qū)域,選擇 VEGF蛋白表達(dá)較強(qiáng)的區(qū)域,400倍顯微鏡下觀察,隨機(jī)選擇 5個(gè)視野,兩人雙盲計(jì)數(shù) 500個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞胞漿內(nèi)棕褐色染色),取均值。VEGF蛋白表達(dá)率計(jì)算公式同前。對(duì) 4組各時(shí)間點(diǎn) MVD值、VEGF蛋白表達(dá)分別與凋亡率計(jì)算 r值。

2 結(jié) 果

2.1 一般狀態(tài) 在實(shí)驗(yàn)過程中因操作不慎死亡或腫瘤失敗的大鼠予以重新補(bǔ)充。大鼠接種后均無感染,從接種后第 3天開始,部分大鼠逐漸出現(xiàn)消瘦、肢活動(dòng)不靈活、抽搐、易激惹等表現(xiàn),瀕死前 4組均表現(xiàn)頻發(fā)抽搐、極度消瘦、惡液質(zhì)等癥狀。

2.2 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 檢測(cè)結(jié)果(見表1,見圖1、圖2)。HMME組和對(duì)照組凋亡細(xì)胞極少,各時(shí)間點(diǎn)凋亡率比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。切片均未見明顯壞死細(xì)胞,偶見凋亡細(xì)胞。US組處理后 24h,切片可見小片狀壞死區(qū)和散在分布的壞死細(xì)胞,凋亡細(xì)胞散在分布,凋亡率高于 HMME組和對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;處理后 3d切片可見散在壞死細(xì)胞,偶見凋亡細(xì)胞,凋亡率較處理后 24h下降,與 HMME組和對(duì)照組比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;處理后 7d,切片未見明顯壞死細(xì)胞,偶見凋亡細(xì)胞,凋亡率與 HMME組和對(duì)照組比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SDT組處理后24h,切片可見明顯片狀壞死區(qū)或壞死細(xì)胞,凋亡細(xì)胞多分布于片狀壞死區(qū)周邊,或與壞死細(xì)胞夾雜,凋亡率明顯高于其它 3組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;處理后 3d,切片見片狀壞死區(qū)明顯縮小、壞死細(xì)胞數(shù)量明顯減少,凋亡細(xì)胞少見,但凋亡率與其它 3組比較,仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;處理后 7d,切片未見壞死細(xì)胞,凋亡細(xì)胞偶見,凋亡率與其它 3組比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 MVD、VEGF蛋白表達(dá)結(jié)果 結(jié)果(見表2、表3,見圖3～圖6)。HMME組和對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)MVD、VEGF蛋白表達(dá)比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2項(xiàng)染色在瘤組織內(nèi)分布不均勻,瘤組織與正常腦組織交界區(qū)表達(dá)相對(duì)較強(qiáng)。切片均未見明顯壞死細(xì)胞。US組處理后 24h,MVD、VEGF蛋白表達(dá)與 HMME組和對(duì)照組比較,略下降,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,切片可見小片狀壞死區(qū)和散在分布的壞死細(xì)胞;處理后 3d,2項(xiàng)表達(dá)結(jié)果與HMME組和對(duì)照組類似,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,切片可見散在壞死細(xì)胞;處理后 7d,2項(xiàng)表達(dá)結(jié)果與 HMME組和對(duì)照組類似,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,切片未見明顯壞死細(xì)胞。SDT組處理后 24h MVD、VEGF蛋白表達(dá)與其它3組比較,明顯下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,切片可見明顯片狀壞死區(qū)或壞死細(xì)胞;處理后 3d,二者表達(dá)有所升高,但仍較其它3組低,與其它 3組比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,切片見片狀壞死區(qū)明顯縮小、壞死細(xì)胞數(shù)量明顯減少;處理后 7d,除MVD結(jié)果與HMME組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0496)外,MVD與 US或?qū)φ战M比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。VEGF表達(dá)率與其它 3組類似,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,切片未見明顯壞死細(xì)胞。SDT組和 US組 MVD密度較高、VEGF蛋白表達(dá)較強(qiáng)的區(qū)域壞死細(xì)胞分布較少。SDT組 MVD與凋亡率的 r=-0.81(P＜0.01);VEGF蛋白表達(dá)率與凋亡率的 r=-0.93(P＜0.01)。

表1 4組大鼠凋亡率(%)的比較(±s,n=8)

表1 4組大鼠凋亡率(%)的比較(±s,n=8)

與 SDT組比較△P＜0.01;與對(duì)照組比較*P＜0.01

24h(%) 3d(%) 7d(%)SDT組US組HMME組對(duì)照組25.10±0.82*6.28±0.68△*0.30±0.30△0.43±0.38△1.23±0.54*0.35±0.40△0.18±0.23△0.38±0.36△0.23±0.23 0.13±0.28 0.28±0.51 0.23±0.29

表2 4組大鼠 MVD的比較(±s,n=8)

表2 4組大鼠 MVD的比較(±s,n=8)

與 SDT組比較△P＜0.05,△△P＜0.01;與對(duì)照組比較*P＜0.01

24h 3d 7d SDT組US組HMME組對(duì)照組27.88±1.15*71.28±1.34△△71.65±1.25△△72.08±1.46△△44.15±1.01*74.05±1.23△△74.28±1.05△△73.70±1.68△△71.33±1.18 71.35±1.13 72.58±1.04△71.93±1.37

表3 4組大鼠 VEGF蛋白表達(dá)率(%)的比較(±s,n=8)

表3 4組大鼠 VEGF蛋白表達(dá)率(%)的比較(±s,n=8)

與 SDT組比較△P＜0.01;與對(duì)照組比較*P＜0.01

24h(%) 3d(%) 7d(%)SDT組US組HMME組對(duì)照組8.98±0.59*45.83±2.28△46.00±1.92△47.20±1.27△35.83±1.28*47.90±1.32△47.08±0.85△47.25±2.01△46.98±0.81 46.45±1.54 46.83±0.59 47.10±1.28

3 討 論

惡性膠質(zhì)瘤有豐富的異常血管,內(nèi)皮細(xì)胞的活化和增生是腫瘤血管生成的前提,在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中,腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的各種促血管生長(zhǎng)因子作用的主要靶細(xì)胞亦是內(nèi)皮細(xì)胞,而 VEGF是膠質(zhì)瘤血管生成的主要調(diào)節(jié)因子,膠質(zhì)瘤新生毛細(xì)血管的密度與膠質(zhì)瘤產(chǎn)生的 VEGF表達(dá)量呈正相關(guān)[3]。VEGF分子量為 34～46kD,是多肽血管生長(zhǎng)因子,膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的 VEGF通過旁分泌方式作用于血管內(nèi)皮受體,經(jīng)酪氨酸激酶?jìng)鲗?dǎo)通路發(fā)揮功效。VEGF功能是：(1)增加 MV通透性,促進(jìn)血漿纖維蛋白外滲,為血管生成過程中多種細(xì)胞遷移提供了纖維網(wǎng)絡(luò);(2)通過與內(nèi)皮細(xì)胞上兩個(gè) VEGF受體 Flt1(fms樣酪氨酸激酶)和 flk(胎肝激酶)作用,直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖,并產(chǎn)生纖維蛋白溶解酶原激活劑(組織型和尿激酶型)和膠原酶等。這不僅可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞移位,有利于血管生成,而且還有利于腫瘤細(xì)胞脫落進(jìn)入血管或向鄰近纖維蛋白和結(jié)締組織基質(zhì)擴(kuò)散,為腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。2003年李永利的研究表明[4],應(yīng)用 VEGF抗體不但可抑制大鼠 C6膠質(zhì)瘤的血管形成及腫瘤生長(zhǎng),還可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

研究已經(jīng)證實(shí) SDT可引起體外 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[1],通過原位細(xì)胞凋亡檢查,發(fā)現(xiàn)大鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤在 SDT處理后早期(24h)腫瘤組織凋亡達(dá)到高峰,隨后凋亡的瘤細(xì)胞均逐漸減少,至處理后 7d時(shí)腫瘤組織中已見不到凋亡的瘤細(xì)胞,這表明凋亡是SDT殺傷膠質(zhì)瘤的重要方式,凋亡高峰出現(xiàn)于處理后早期(24h),但凋亡時(shí)間較體外(6h)略后移,這可能因?yàn)?US作用于體外細(xì)胞時(shí)衰減低,而作用于顱腦組織中衰減增強(qiáng),與較低的聲強(qiáng)度啟動(dòng)細(xì)胞凋亡時(shí)間較長(zhǎng)有關(guān)。24h后細(xì)胞凋亡明顯減少,處理后 7d,4組凋亡率已無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明 SDT僅在處理后24h內(nèi)對(duì)細(xì)胞凋亡存在明顯影響,而中遠(yuǎn)期則無影響。US處理后也可引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡,其高峰同樣發(fā)生在早期(24h),但腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯較 SDT低,提示,凋亡也是 US殺傷體內(nèi)膠質(zhì)瘤的方式之一。單用 HMME未顯示出對(duì)細(xì)胞凋亡有影響。

我們觀察了 4組大鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤 MVD、VEGF的變化,結(jié)果表明,SDT處理后極早期(24h)MVD及VEGF表達(dá)明顯下降,處理后早期(3d)MVD及 VEGF表達(dá)有所上升,但仍較其它 3組低,直至處理后中期(7d)VEGF表達(dá)才恢復(fù)正常。MVD與 HMME組比較,雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但 P=0.0496,結(jié)果尚需具體分析。這提示 SDT對(duì)體內(nèi)膠質(zhì)瘤殺傷有明顯的血管靶向作用。SDT處理后 MVD及 VEGF表達(dá)結(jié)果與凋亡率成負(fù)相關(guān)(P＜0.01),提示 SDT可通過損傷血管、抑制腫瘤的血管形成、造成腫瘤細(xì)胞缺血、缺氧,從而引起腫瘤細(xì)胞中低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)表達(dá)增加,通過bcl-2途徑誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[4]。單用 US和單用HMME后 MVD及 VEGF表達(dá)強(qiáng)度與對(duì)照組無明顯差異,提示US和 HMME無血管靶向作用,US的抑瘤效應(yīng)可能與血管靶向作用無關(guān)。

圖1 SDT組原位細(xì)胞凋亡檢測(cè),處理后 24h

圖2 SDT組原位細(xì)胞凋亡檢測(cè),處理后 3d

圖3 SDT組處理后 24h CD34蛋白表達(dá)

圖4 SDT組處理后 3d CD34蛋白表達(dá)

圖5 SDT組處理后 24h VEGF蛋白表達(dá)

圖6 SDT組處理后 3d VEGF蛋白表達(dá)

[1]宋大勇,岳 武,趙 釗,等.聲動(dòng)力化學(xué)療法對(duì)體外 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用的研究[J].中華神經(jīng)外科雜志,2007,23(2)：107-110.

[2]劉 斌,金必連,李 齡.激光間質(zhì)那熱療聯(lián)合順鉑治療大鼠腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)激光醫(yī)學(xué)雜志,2001,10(2)：74-77.

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