王 巖, 張桂運(yùn), 陳左權(quán)

近年來諸多研究證實(shí),粒/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)可誘導(dǎo)大量側(cè)支循環(huán)建立,并有望成為那些不適合手術(shù)或介入治療的廣泛微小動(dòng)脈狹窄的缺血性心血管疾病患者的治療選擇之一[1]。

但此類研究在缺血性腦血管疾病的應(yīng)用方面涉及較少。我們?cè)诩韧膶?shí)驗(yàn)中,嘗試將兔動(dòng)脈粥樣硬化模型右側(cè)鎖骨下動(dòng)脈椎動(dòng)脈開口近端結(jié)扎,在盡可能地模擬人類動(dòng)脈粥樣硬化的情況下,逐漸出現(xiàn)腦血液循環(huán)低灌注的動(dòng)態(tài)病理生理過程。

在此模型基礎(chǔ)上,本科題組研究證實(shí)了 GMCSF可以顯著促進(jìn)該模型腦組織缺血敏感區(qū)(前、后分水嶺區(qū)域)血管生成[2],但尚未對(duì) GM-CSF治療后腦血液循環(huán)狀態(tài)及顱內(nèi)血管功能變化進(jìn)行深入的評(píng)估。

在研究中,我們就 GM-CSF誘導(dǎo)顱內(nèi)血管生成后,GM-CSF是否改善全腦血液循環(huán)狀態(tài)以及 GMCSF誘導(dǎo)顱內(nèi)血管生成可能的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行初步探討,為探索一種可行的預(yù)防性治療缺血性腦血管疾病的方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只雄性新西蘭大白兔(體重 2.0～3.0Kg,由同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。隨機(jī)分為對(duì)照組 (ctr)、動(dòng)脈粥樣硬化組(AS)、生理鹽水治療組(NS)、GM-CSF治療手術(shù)模型組(GM-CSF),每組 10只。ctr組喂以基礎(chǔ)飼料(普通顆粒飼料,自由飲水);余 3組均喂以高脂飼料(1%膽固醇 +5%豬油 +5%蛋黃粉 +89%基礎(chǔ)飼料)。第 12周,各組均接受開胸并結(jié)扎右側(cè)鎖骨下動(dòng)脈椎動(dòng)脈開口近端。各組動(dòng)物術(shù)后均給予肌肉注射頭孢替胺,每天一次,每日0.5g,連續(xù) 3d。GMCSF組給予皮下注射 GM-CSF,劑量為 40μg/kg-1,qd alt,共 3w;NS組皮下注射等體積的生理鹽水,隔日一次,共 3w。ctr、AS組不予任何治療。造模后,每組隨機(jī)抽取 2只,行 DSA及頸動(dòng)脈血管病理學(xué)檢查,證實(shí)造模成功。

1.2 藥物、儀器與試劑 GM-CSF購于廈門特保生物工程股份有限公司;雙 C臂三維數(shù)字血管造影機(jī)(DSA)由美國 GE公司生產(chǎn);Western Blot儀器由美國伯樂公司生產(chǎn);腦血管血液動(dòng)力學(xué)檢測儀(CV-300)由上海麥登電子設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.3 腦血管 CVHI檢測方法 30%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉(1ml/kg)成功后,切開皮膚,充分暴露雙側(cè)頸動(dòng)脈,一側(cè)插管,接換能器,進(jìn)行血壓監(jiān)測;另一側(cè)使用 CV-300多普勒超聲探頭檢測頸動(dòng)脈血液流速。系統(tǒng)根據(jù)超聲探頭及壓力傳感器測定的流速及壓力數(shù)值,自動(dòng)計(jì)算出各組相應(yīng)的CVHI值。

1.4 Western Blot分析 提取腦組織蛋白,Bradford法測定濃度。按照計(jì)算的蛋白量加樣后電泳。10%的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)作為分離膠。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(PVDF)膜上,用 5%的脫脂牛奶封閉 2h。加入新鮮 PEDF或VEGF一抗((Santa Cruz Biotechnology,USA),4℃孵育過夜。次日取 PVDF膜,TBST洗滌 3次。加入二抗(Santa Cruz Biotechnology,USA),室溫孵育 1h。TBST洗滌 3次,加 ECL發(fā)光底物,暗室曝光、定影、晾干。利用 Gel-Pro軟件進(jìn)行密度掃描定量分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用 SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,結(jié)果以均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以 P＜0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兔腦血管 CVHI檢測 AS及 NS組雙側(cè)頸動(dòng)脈 Vmin較 ctr組明顯減慢(P＜0.01),Vmax各組間無顯著性差異(P＞0.05),Wv和 Rv值顯著升高(P＜0.01);AS與 NS組之間 CVHI無明顯差異(P＞0.05);GM-CSF組較 AS及 NS組的頸動(dòng)脈Vmin顯著增快(P＜0.01),Vmax各組間無顯著性差異(P＞0.05)。同時(shí),Wv及 Rv值較 AS及 NS組低(P＜0.01)(見表1)。

2.2 GM-CSF對(duì)兔腦組織缺血敏感區(qū)域 PEDF及 VEGF蛋白表達(dá)影響

2.2.1 前分水嶺區(qū)域腦組織 PEDF及 VEGF蛋白表達(dá) Western blot分析顯示,AS組、NS組前分水嶺區(qū)域腦組織的PEDF及VEGF蛋白表達(dá)較ctr組均有增加(P＜0.05);AS組與 NS組之間的 PEDF蛋白表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05);GM-CSF組PEDF蛋白表達(dá)較其它各組降低顯著(P＜0.01),但仍高于 ctr組(P＜0.01)。但是,AS、NS及 GM-CSF組之間的 VEGF蛋白表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)(見圖1A、圖1B)。

2.2.2 后分水嶺區(qū)域腦組織 PEDF及 VEGF蛋白表達(dá)的變化 Western blot分析顯示,AS組、NS組后分水嶺區(qū)域腦組織的 PEDF及 VEGF蛋白表達(dá)較 ctr組明顯增加(P＜0.01);AS組與 NS組之間的PEDF、VEGF蛋白表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05);而GM-CSF組 PEDF蛋白表達(dá)較 AS及 NS組顯著降低(P＜0.01),但仍高于 ctr組(P＜0.01)。同時(shí),GMCSF組 VEGF蛋白表達(dá)較其它 3組呈升高趨勢(shì),且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)(見圖2 A、圖2B)。

表1 各組頸動(dòng)脈系統(tǒng)腦血管血液動(dòng)力指標(biāo)(CVH I)變化(±s)

表1 各組頸動(dòng)脈系統(tǒng)腦血管血液動(dòng)力指標(biāo)(CVH I)變化(±s)

與正常對(duì)照組相比*P＜0.05,**P＜0.01;與動(dòng)脈粥樣硬化模型組相比#P＜0.05,##P＜0.01(組數(shù)：8組)

組別Vmax(cm/s)

圖1 A 各組前分水嶺區(qū)域腦組織 PEDF及 VEGF因子蛋白表達(dá),編號(hào) 1～4依次為ctr組、AS組、NS組、GM-CSF組。圖1B 各組前分水嶺區(qū)域腦組織 PEDF及 VEGF因子蛋白表達(dá)定量分析,與正常對(duì)照組相比*P＜0.05,**P＜0.01;與動(dòng)脈粥樣硬化模型組相比#P＜0.05,##P＜0.01(組數(shù)：5組)

圖2 A 各組后分水嶺區(qū)域腦組織 PEDF及 VEGF因子蛋白表達(dá),編號(hào) 1～4依次為ctr組、AS組、NS組、GM-CSF組。圖2B 各組后分水嶺區(qū)域腦組織 PEDF及VEGF因子蛋白表達(dá)定量分析,與正常對(duì)照組相比*P＜0.05,**P＜0.01;與動(dòng)脈粥樣硬化模型組相比#P＜0.05,##P＜0.01(組數(shù)：5組)

3 討 論

眾所周知,腦分水嶺區(qū)是指大腦的兩條主要?jiǎng)用}分布區(qū)的交界處。當(dāng)動(dòng)脈粥樣硬化所致腦供血不足時(shí),這些部位最易并且最早出現(xiàn)缺血、缺氧等病理生理性改變。在這些腦缺血的敏感區(qū)域觀察到 GM-CSF具有誘導(dǎo)血管生成的生物學(xué)效應(yīng),對(duì)于腦缺血的預(yù)防性治療具有非常重要的指導(dǎo)意義。然而,雖然我們前期實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了 GM-CSF治療誘導(dǎo)腦組織缺血敏感區(qū)血管生成,但是這些新生成的血管是否能夠改善全腦血液循環(huán)狀態(tài)尚未進(jìn)行評(píng)估。

在本實(shí)驗(yàn)中,我們利用 CV-300血液動(dòng)力學(xué)檢測儀對(duì)各組兔的 CVHI進(jìn)行檢測。檢測指標(biāo)包括：頸動(dòng)脈最大血流速度(Vmax)、最小血流速度(Vmin)、脈搏波波速(Wv)、腦血管外周阻力(Rv)等。大量臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,CVHI的異常變化與缺血性腦血管疾病的發(fā)生與發(fā)展有著密切聯(lián)系,其異常變化往往早于影像學(xué)改變。在血液動(dòng)力學(xué)諸指標(biāo)中,Vmin是反映腦血管損害最為敏感的指標(biāo),與卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系最為密切[3]。而 Wv是反映動(dòng)脈彈性較為敏感的指標(biāo);Rv則是反映中、小血管(直徑 20～400μm)通暢程度的最具代表性的定量指標(biāo)。當(dāng)動(dòng)脈粥樣硬化時(shí),Wv和 Rv這兩個(gè)指標(biāo)將會(huì)出現(xiàn)不可逆的持續(xù)性增高[4]。而且,前瞻性隊(duì)列研究表明,兩者與卒中發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)也有密切關(guān)系[5]。通過以上參數(shù)的測定,不僅可以評(píng)估腦血管血液循環(huán)的狀態(tài),而且在一定程度上可以反映腦血管的生理功能情況。

通過比較各組 CVHI發(fā)現(xiàn),AS及 NS組雙側(cè)頸動(dòng)脈Vmin較ctr組明顯減慢,Wv和Rv值顯著升高。這說明非治療組兔腦血管功能降低,同時(shí)顱內(nèi)中、小血管通暢程度明顯下降,血管床的血流阻力增加;而GM-CSF治療組兔頸動(dòng)脈 Vmin較 AS及 NS組顯著增快,同時(shí) Wv及 Rv值較 AS及 NS組低。這提示我們,預(yù)防性的皮下注射 GM-CSF誘導(dǎo)生成的血管,可以預(yù)先建立良好的側(cè)支循環(huán)網(wǎng)絡(luò),通過改善小血管通暢程度、降低血管床阻力、發(fā)揮改善全腦血液循環(huán)狀態(tài)的作用。這一結(jié)論與國內(nèi)外報(bào)道基本一致[6,7]。

另外,對(duì)于 GM-CSF促進(jìn)血管生成,誘導(dǎo)側(cè)枝循環(huán)建立的機(jī)制問題,目前說法不一。近年來,在血管生成的調(diào)控機(jī)制上,Hanahan和 Folk-man等提出了“血管生成平衡學(xué)說”,即血管的病理生理變化主要取決于血管生成誘導(dǎo)因子和抑制因子之間的平衡,一旦此平衡打破,就會(huì)激活血管系統(tǒng)向某一狀態(tài)失衡,進(jìn)而誘導(dǎo)血管生成或抑制血管生成平衡系統(tǒng)使血管壁重構(gòu),最終導(dǎo)致血管的病理性改變[8]。目前,這一理論被國內(nèi)外學(xué)術(shù)界所公認(rèn)。根據(jù)此理論,我們可以推測：不論 GM-CSF誘導(dǎo)血管生成通過何種途徑發(fā)揮效應(yīng),最終都要影響和干預(yù)血管生成系統(tǒng)中的相關(guān)因子的平衡才得以實(shí)現(xiàn)。而在參與此調(diào)節(jié)的諸多影響因子中,PEDF及 VEGF是血管生成調(diào)控的兩大關(guān)鍵因子,兩者動(dòng)態(tài)的平衡在血管生成調(diào)節(jié)過程中起著非常重要的作用。VEGF是主要的血管生成誘導(dǎo)因子,其主要的生理作用就是特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移和血管生成。PEDF則具有極強(qiáng)的抑制血管生成的生物學(xué)效應(yīng)[9,10]。

雖然目前尚無 GM-CSF影響 VEGF及 PEDF因子的表達(dá)水平,并進(jìn)而干預(yù)血管生成系統(tǒng)平衡的直接證據(jù),但是從我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來看,GM-CSF治療組的前、后分水嶺區(qū)域腦組織 PEDF蛋白表達(dá)較動(dòng)脈粥樣硬化組及生理鹽水組低很多,這提示我們GM-CSF很可能抑制了模型組兔腦組織的 PEDF表達(dá)。而對(duì)于 GM-CSF與 VEGF兩者之間的相互作用關(guān)系,結(jié)果顯示,GM-CSF治療組的前、后分水嶺區(qū)腦組織 VEGF蛋白的表達(dá)均略高于未治療組。雖然在前分水嶺區(qū)腦組織樣本中,GM-CSF治療組與 AS組及 NS組之間無顯著性差異,但就總的趨勢(shì)而言,GM-CSF治療后,前、后分水嶺區(qū)域腦組織的 VEGF蛋白表達(dá)水平確實(shí)呈持續(xù)增高趨勢(shì)。

總之,以上的研究證實(shí)了預(yù)防性的皮下注射GM-CSF能夠誘導(dǎo)血管的生成,并可以預(yù)先建立良好的側(cè)支循環(huán)網(wǎng)絡(luò),進(jìn)而可以改善腦組織的血液循環(huán)。這一結(jié)論與國內(nèi)外報(bào)道基本一致。同時(shí),根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測：GM-CSF抑制了動(dòng)脈粥樣硬化腦組織的 PEDF因子表達(dá);而對(duì)另一種促進(jìn)血管再生的因子 VEGF,則可能起到了直接或間接上調(diào)的作用。這將會(huì)使腦組織中抑制血管生成的能力得到減弱,而促進(jìn)血管生成的能力得到增強(qiáng),進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)血管生成的作用。

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