李春雨， 李彥明， 王 樹， 薛貴平， 張丹參

(1.河北北方學(xué)院，河北張家口075000;2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口075000)

菟絲子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，是常用補益中藥，具有補腎益精，養(yǎng)肝明目，安胎之功效［1］，其主要成分有黃酮、多糖、糖苷、氨基酸及微量元素等［2］。由于其質(zhì)地堅硬，不利于粉碎和煎煮出有效成分，故臨床多以炮制品入藥。菟絲子歷代炮制方法有黃精汁浸、鹽炒、酒蒸、酒浸炒、清炒等十余種。現(xiàn)代研究也取得一定進展，張素茂［3］以浸出率為指標(biāo)研究高壓蒸煮法炮制菟絲子的可行性。曾詮［4］以總黃酮為指標(biāo)，比較了鹽炙、酒炙、炒黃3種炮制方法。李波［5］用正交設(shè)計以總黃酮為指標(biāo)優(yōu)選了菟絲子黃酒炮制工藝。田樹革［6］對菟絲子鹽炙品及100～160℃之間的烘制品中黃酮及多糖含量進行了比較研究。黃繼全［7］對菟絲子的生品、不同方法炮制品的水浸出物做了比較研究。張德昌等［8］對藥典中菟絲子所規(guī)定的“鹽炙法”炮制提出商榷，認為“酒炙法”比“鹽炙法”更具臨床實用意義。但是菟絲子酒炙的要求僅有具酒氣等經(jīng)驗指標(biāo)，沒有其酒炙飲片客觀科學(xué)的炮制工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本實驗采用均勻設(shè)計和回歸分析優(yōu)化菟絲子酒炙工藝，為合理利用其炮制品提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-2100紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司);102-3型遠紅外線快速干燥箱(北京興爭儀器設(shè)備廠);JN-5200D超聲波清洗器(寧波江南儀器廠);DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器(金壇市醫(yī)療儀器廠);蘆丁對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號是100080-200707);無水葡萄糖對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號是:110833-200503);市售紹興黃酒;試驗中所用菟絲子購自河北安國藥材市場，經(jīng)我院藥學(xué)教研室高級實驗師薛貴平鑒定為旋花科植物Cuscuta chinensis Lam的干燥成熟種子。其他所用試劑均為分析純。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 均勻試驗設(shè)計 菟絲子酒炙工藝考慮的影響因素有加酒量，悶潤時間，烘制溫度，烘制時間，以總黃酮，總多糖，水浸出物，醇浸出物為指標(biāo)，每個因素安排9個水平，應(yīng)用均勻設(shè)計U9(94)表安排試驗，因素水平見表1。

2.2 藥材炮制操作過程 取100 g凈菟絲子藥材，加入一定比例的黃酒拌勻，密閉悶潤，然后置于恒溫箱中加熱至設(shè)定時間，取出放涼。粉碎過60目篩，備用。

2.3 總黃酮含量測定

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取蘆丁對照品10.4 mg置50 mL量瓶中，加乙醇適量，稍加熱助溶，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

表1 均勻設(shè)計因素水平表

2.3.2 供試品溶液制備 精密稱取樣品粉末1 g，加95%乙醇30 mL，超聲提取1 h，濾入50 mL量瓶中，殘渣以5 mL乙醇洗滌3次，合并濾液至量瓶中，加乙醇至刻度。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［6］502 nm處測定吸收度，以吸收度為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程是Y=89.001X－2.317 7，r=0.999 1，結(jié)果表明在20.8～72.8μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 分別精密稱取同批號生品6份如前供試品溶液制備及測定法操作，測得平均含量為2.75%，RSD=2.31%(n=6)。

2.3.5 精密度試驗 將對照品溶液連續(xù)測定6次，測得吸收度均值為0.498 6，RSD=0.11%，(n=6)。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 將樣品溶液在0、15、30、45、60、75 min依法測定，平均含量為2.67%，RSD=2.12%，結(jié)果表明供試品溶液在75 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收試驗 精密吸取已知含量的凈菟絲子供試品溶液共6份，分別加入0.21 mg/mL對照品溶液 1.0 mL，依法測定，計算回收率為100.2%，RSD為2.24%，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗表(n=6)

2.3.8 供試品溶液測定 精密吸取供試品溶液1.0 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下方法操作，代入回歸方程計算含量，結(jié)果見表3。

表3 均勻設(shè)計用表和實驗結(jié)果

2.4 多糖含量測定

2.4.1 對照品溶液的制備 精密稱取無水葡萄糖對照品15.2 mg置25 mL量瓶中，加適量蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［6］492 nm處測定吸收度，以吸收度為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程是Y=119.89X－6.283 7，r=0.999 6，結(jié)果表明在12.16～85.12μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 供試品中多糖含量測定 將提取總黃酮后的殘渣及濾紙置燒瓶中，加水60 mL，置沸水浴中加熱回流1 h，趁熱過濾，殘渣及燒瓶用熱水洗滌4次，每次5 mL，合并濾液與洗液，放冷，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取0.3 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法，自“加水至2.0 mL”起，依法測定，代入回歸方程計算即得。結(jié)果見表3。

2.5 水、醇浸出物測定 參照2005版藥典附錄Ⅹ項下熱浸法進行測定，結(jié)果見表3。

3 試驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

3.1 均勻設(shè)計用表和實驗結(jié)果 采用中國均勻設(shè)計學(xué)會和東北制藥總廠共同研制的“均勻設(shè)計軟件包”處理數(shù)據(jù)，將試驗結(jié)果通過二次多項式逐步非線性回歸分析，建立回歸模型，結(jié)果見表4和模型擬和對比圖1。

表4 二次多項式逐步非線性回歸結(jié)果

圖1 回歸方程擬和對比圖

F檢驗表明，回歸方程1，3，4在α=0.01的水平上，回歸方程2在α=0.03的水平上均為顯著;從剩余標(biāo)準(zhǔn)差來看，4個響應(yīng)模型均具有良好的預(yù)測精度，大小順序為1>3>4>2;比較回歸方程擬合對比圖，四個圖中的樣本值和擬合值均具有較好的擬合精度，A，B，C圖優(yōu)于D圖;此外，模型的決定系數(shù)也表明回歸方程具有較高的預(yù)測精度。故使用該統(tǒng)計模型預(yù)測菟絲子酒炙工藝參數(shù)對其炮制的影響是可行的。

3.2 工藝條件的優(yōu)化 通過對試驗?zāi)Ｐ透髦笜?biāo)逐一優(yōu)化，得到理論最佳組合值及預(yù)測值，然后根據(jù)回歸方程做出等值線圖，進一步分析各因素對每項指標(biāo)的影響，結(jié)合實際試驗具體情況確定最佳工藝指標(biāo)。具體分析如下:① 總黃酮:X4對結(jié)果影響最顯著，其次是X3，隨著烘制溫度升高、烘制時間延長有利于其含量提高。但是從性狀上來看高溫度導(dǎo)致焦色較深，焦香味較重，酒味較微，故溫度不宜過高。②總多糖:X2和X4交互作用對結(jié)果影響最顯著，其次是X3，隨著悶潤和烘制時間延長含量增大，其次是溫度降低有利。③ 水浸出物:X3對結(jié)果影響最顯著，其次是X1，X4，說明加酒量增多、烘制溫度升高、烘制時間延長含量增大。④醇浸出物:X3和X4交互作用最強，即隨著烘制溫度的降低和烘制時間的延長而增大，其次是X1和X2對結(jié)果的影響是隨著加酒量的增大與悶潤時間的延長而增大。

綜合分析，為了保證四項指標(biāo)都能取相對較大值，得到最優(yōu)工藝條件為 X1=30%，X2=9，X3=100，X4=60。

3.3 驗證試驗 取100 g藥材3份，按優(yōu)化后的條件進行實驗，測定總黃酮、總多糖、水浸出物和醇浸出物的含量為2.93%、33.35%、30.5%和15.5%。

4 討論

4.1 本實驗采用總黃酮、總多糖以及水、醇浸出物四項量化指標(biāo)，綜合評判了菟絲子酒炙的炮制工藝，使其火候評判客觀化，克服傳統(tǒng)單憑經(jīng)驗判斷火候因人而異的主觀性，使其方法更加科學(xué)、合理和可行。

4.2 經(jīng)驗證的最佳炮制工藝各項指標(biāo)與優(yōu)化后的理論值較接近，與其它炮制方案結(jié)果相比占優(yōu)。最終得到菟絲子最優(yōu)酒炙工藝參數(shù)為:加酒量30%，悶潤時間9 h，烘制溫度100℃，烘制時間60 min。說明通過均勻設(shè)計試驗和回歸分析，建立的主要指標(biāo)回歸模型具有較高的精確度和顯著性，且通過回歸模型和等值線圖的直觀分析，利于求得最佳工藝參數(shù)，可作為優(yōu)化本類炮制工藝的分析手段，為其他相關(guān)炮制工藝提供參考，為合理利用菟絲子炮制品提供依據(jù)。

［1］南京中醫(yī)藥大學(xué)編著.中藥大辭典［M］.第2版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006.

［2］郭洪祝，李家實.南方菟絲子化學(xué)成分研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2000，23(3):20.

［3］張素茂.高壓蒸煮法炮制菟絲子［J］.中國中藥雜志，1992，17(9):536.

［4］曾 詮，杜文清，吳洪元，等.菟絲子炮制研究［J］.中草藥，1998，29(10):667-668.

［5］李 波，金承勇.正交法優(yōu)選菟絲子黃酒炮制工藝［J］.中成藥，2003，25(1)43-45.

［6］田樹革，周曉英，肖新芳，等.菟絲子及不同炮制品中有效成分含量的研究［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2001，24(1):68-70.

［7］黃繼全.菟絲子炮制工藝探討［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，18(1):36.

［8］張德昌，曹谷珍.對藥典中菟絲子炮制方法的商榷［J］.中醫(yī)藥研究，2001，17(1):50.