藺鵬翔，張煥萍，張愛芝

(1.山西醫(yī)科大學，太原 030001;2.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院呼吸內(nèi)科，太原 030001)

TGF－β1對不同階段哮喘模型大鼠氣道平滑肌細胞增殖的作用

藺鵬翔1，張煥萍2，張愛芝1

(1.山西醫(yī)科大學，太原 030001;2.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院呼吸內(nèi)科，太原 030001)

目的 探討TGF－β1對不同階段哮喘大鼠氣道平滑肌細胞(ASMCs)增殖的作用。方法 建立2周、6周哮喘大鼠模型，分別以 1μg/L、10 μg/L和 100 μg/L TGF－β1干預 ASMCs生長。采用流式細胞儀、MTT法檢測ASMCs增殖情況，觀察不同濃度TGF－β1對 ASMCs增殖的影響。結果 2周和6周哮喘組 ASMCs的 S期比例、A值分別為(34.31±1.41)%、(35.96±3.46)%;(0.546±0.005)、(0.559±0.009)與對照組(12.24±2.64)%、(0.289±0.009)比較均顯著增高(均 P＜0.01)。2周、6周哮喘模型組的各 TGF－β1干預組 ASMCs的 S期比例、A值與各自哮喘組比較均顯著升高(均 P ＜0.01)，10 μg/L 和 100 μg/L TGF－β1組比 1 μg/L TGF－β1組對 ASMCs增殖作用明顯增加(P ＜0.01)，10 μg/L TGF－β1組和 100 μg/L TGF－β1組相比，ASMCs增殖細胞占細胞總數(shù)的百分比無明顯變化，兩種濃度增殖作用無有明顯差別(P＞0.05)。而2周和6周哮喘組相比，加入不同濃度 TGF－β1干預后的差別不大(P＞0.05)。結論 與正常鼠相比，2周和6周哮喘大鼠氣道平滑肌細胞增殖明顯，處于 S期的細胞比例明顯增高，6周哮喘大鼠氣道平滑肌較2周哮喘大鼠增殖更明顯。經(jīng)TGF－β1干預后，2周和6周哮喘哮喘大鼠氣道平滑肌細胞處于 S期的細胞比例增加，增殖增強，提示TGF－β1可能在哮喘早期階段即可促進大鼠氣道平滑肌細胞增殖，并促進各階段哮喘大鼠氣道平滑肌細胞持續(xù)增殖。

轉化生長因子－β1;氣道平滑肌細胞;增殖

哮喘被認為是一種氣道慢性非特異性炎癥性疾病，許多細胞因子和炎癥介質(zhì)參與了這個病理生理過程。轉化生長因子－β1(transforming growth factor，TGF－β1)作為一種多功能的調(diào)節(jié)細胞生長、分化的細胞因子，在哮喘中可由多種活化的細胞產(chǎn)生，被認為具有促纖維化和抗炎等作用［1］。研究發(fā)現(xiàn) TGF－β1是一種多向性細胞因子，在哮喘患者氣道組織中表達增高，參與哮喘氣道炎癥反應和免疫應答，并且通過刺激氣道平滑肌細胞增生、肥大，誘導氣道成纖維細胞向成肌纖維細胞轉化，促進細胞外基質(zhì)蛋白合成和上皮下纖維化形成，是引起哮喘氣道重構的重要細胞因子［2］。體外研究也表明:轉化生長因子－β(TGF－β)可促進正常及哮喘氣道平滑肌細胞(ASMCs)增殖［3］。而轉化生長因子－β1(TGF－β1)對哮喘急性期ASMCs增殖及慢性哮喘ASMC增殖的調(diào)節(jié)作用尚不十分清楚。

本實驗通過制備大鼠哮喘急性期模型及慢性哮喘模型，培養(yǎng)大鼠葉支氣管 ASMCs，用不同濃度的TGF－β1干預細胞生長，觀察ASMCs的增殖，探討TGF－β1在哮喘平滑肌細胞增殖中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

胎牛血清(杭州四季青生物所);小鼠抗α平滑肌肌動蛋白(α－actin)單克隆抗體(博士德公司);DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司);卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)、I型膠原酶(collagenase)(美國Sigma公司);轉化生長因子－β1(TGF－β1)購自武漢博士德公司;PCR引物、內(nèi)參照三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物由上海生工生物工程公司合成，余為進口或國產(chǎn)試劑，分析純。

1.2 方法

1.2.1 大鼠哮喘模型的建立:15只健康雄性Wistar大鼠(合格證號:山醫(yī)字第 070101)分為三組，體重200～250 g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。適應性喂養(yǎng)1周后，第1天大鼠腹腔注射含100 mg OVA和200 mg氫氧化鋁的生理鹽水1mL，同時腹腔注射百日咳桿菌疫苗1mL(約6×109個菌株)作為佐劑，第8天重復致敏1次，第15天開始激發(fā)，將大鼠置于特制玻璃容器內(nèi)，用超聲霧化器噴入 2%OVA生理鹽水 50mL，激發(fā) 30 min，每天1次，一組激發(fā)2周(哮喘早期階段)，另一組激發(fā)6周(慢性哮喘模型)。激發(fā)后大鼠出現(xiàn)煩躁、嗆咳、呼吸加快及輕度紫紺等哮喘發(fā)作癥狀即為模型制作成功。正常大鼠以等量生理鹽水代替 OVA注射，并吸入生理鹽水50mL 2周。

1.2.2 ASMCs的分離、培養(yǎng)及鑒定:參照 Johnson等［4］的培養(yǎng)方法，上述大鼠腹腔注射 25% 烏拉坦(4mL/kg)麻醉后，開胸迅速取出肺臟置于預先冰浴的D－h(huán)anks＇溶液，在解剖顯微鏡下仔細分離出葉支氣管，并將支氣管外膜剝離干凈，刮除內(nèi)皮，將獲得的單層ASM在小燒杯中剪成1mm×1mm的小塊后，加入1 g/LⅠ型膠原酶，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中消化1 h后加入 DMEM液，混勻后用200目金屬濾網(wǎng)過濾，濾液置離心管內(nèi)1000 r/min離心5 min。棄上清后，沉淀的細胞用含20%FBS、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL的 DMEM 培養(yǎng)液重懸，接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)，讓細胞貼壁生長。原代培養(yǎng)的細胞生長約7～10 d后融合。0.25% 胰蛋白酶消化傳代，用含10%FBS、青霉素 100 U/mL、鏈霉素 100 U/mL的DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，每2～3天換液1次，約3～4 d細胞長滿后傳代，3～7代的細胞用于實驗。小鼠平滑肌 α－肌動蛋白(α－actin)免疫細胞化學染色鑒定為ASMCs。

1.2.3 實驗分組:各組哮喘模型大鼠均取第3～7代培養(yǎng)的氣道平滑肌細胞，0.25%胰蛋白酶消化，臺盼藍染色法計數(shù)，細胞存活率大于 96%。用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)，待細胞90%融合后，換無血清DMEM培養(yǎng)24 h，使細胞生長同步于G0期，換用含10%FBS的 DMEM液，隨機分為5組:(1)對照組:培養(yǎng)的正常大鼠氣道平滑肌細胞，每孔/瓶中不加任何干預 ;(2)模型組:培養(yǎng)的哮喘大鼠氣道平滑肌細胞，每孔/瓶中不加任何干預;(3)、(4)、(5)組分別為不同濃度的 TGF－β1干預組:培養(yǎng)的哮喘大鼠氣道平滑肌細胞，每孔/瓶中分別加入終濃度為每孔 /瓶中分別加入終濃度為 1 μg/L、10 μg/L 及100 μg/L的 TGF－β1;各組加入試劑后放入 CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h，進行下述實驗，每 4個復孔/瓶為一組，實驗重復3次。

1.2.4 細胞增殖檢測

1.2.4.1 流式細胞儀分析 ASMCs細胞周期:各組ASMCs按106/mL的密度接種于100cm2的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)及分組如前述，收集的 ASMCs用 PBS液配制成濃度為 1×106個/mL的細胞懸液，用預冷的75% 乙醇固定，加入 RNA酶、碘化丙啶室溫作用后，用 FACSort型流式細胞儀(美國 BD公司)Cellquest軟件分析細胞周期中各期所占的百分比。

1.2.4.2 四甲基偶氮唑藍(MTT)微量比色法測定ASMCs增殖:96孔板內(nèi)的ASMCs培養(yǎng)結束時，每孔加 MTT(5 g/L)20 μL，培養(yǎng) 4 h后去培養(yǎng)液，加二甲基亞砜 150 μL振蕩 30 min，使結晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm處測定各孔 A值。

1.2.5 統(tǒng)計學方法:應用統(tǒng)計分析軟件包SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。組間差異顯著性檢驗采用方差分析，兩兩比較采用 q檢驗。

圖3 流式細胞儀分析各組大鼠氣道平滑肌細胞周期Fig.3 Analysis of cell cycle of ASMCs by flow cytometry

2 結果

2.1 細胞鑒定

在倒置顯微鏡下，經(jīng)原代培養(yǎng)的 ASMCs呈梭形，有較長的突起，圓形的細胞核位于細胞中央，呈疏密相間、典型“峰和谷”生長狀態(tài)(圖1)。α－actin免疫細胞化學染色，免疫反應產(chǎn)物呈棕黃色。97%細胞 α－actin染色陽性，所培養(yǎng)的細胞為平滑肌細胞［5］(圖2)(圖1～2，見彩插 5)。

2.2 流式細胞儀分析 ASMCs細胞周期

與對照組 ASMCs比較，2周及 6周哮喘組ASMCs的G0/G1期細胞所占比例均明顯減少(P＜0.01)，S期細胞所占比例均增高(P＜0.01)，表明處于有絲分裂期的細胞數(shù)目增多。加入不同濃度TGF－β1共培養(yǎng) 24 h后，各干預組 ASMCs的 S期細胞所占比例較哮喘組均明顯增高(均P＜0.01)(表1和圖3)。

2.3 MTT檢測 ASMCs增殖

與對照組相比，2周和6周哮喘組 ASMCs A值顯著增加(P＜0.01)，2周和6周哮喘組各個 TGF－β1干預組 ASMCs A值與各自哮喘組相比均顯著增高(均 P＜0.01)(表2)。

表1 TGF－β1對哮喘大鼠氣道平滑肌細胞增殖的影響(n=3)Tab.1 TGF－β1effect on cell proliferation of ASMCs in asthmatic rats(n=3)

表2 TGF－β1對哮喘大鼠氣道平滑肌細胞增殖的影響(n=3)Tab.2 TGF－β1effect on cell proliferation of ASMCs in asthmatic rats(n=3)

3 討論

支氣管哮喘是以呼吸道高反應性和不可逆性呼吸道重塑為特點的呼吸道慢性炎性反應性疾病［6］。呼吸道重塑的病理表現(xiàn)為呼吸道上皮細胞的破壞脫落，黏液細胞(SMA)增生和肥大，基底膜增厚，平滑肌細胞增生肥大，血管增生，血管上皮細胞下和黏膜下層纖維化，呼吸道受到慢性炎性反應因子反復刺激引起了呼吸道重塑。其中氣道平滑肌細胞(ASMCs)增殖在氣道重塑中占有十分重要的地位，增殖的 ASMCs使氣道壁增厚，導致基礎氣道阻力增加和不可逆性氣流受限的發(fā)生。ASMCs培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，多種炎癥介質(zhì)和炎性細胞產(chǎn)物均可作用于 ASMCs，在基因水平對 ASMCs的增殖進行調(diào)節(jié)。

近年來，有學者對轉化生長因子－β1(TGF－β1)與哮喘呼吸道重塑的相關性進行了大量研究，認為TGF－β1是致呼吸道重塑的重要細胞因子［7］。研究發(fā)現(xiàn)在不同程度哮喘患者氣道中 TGF－β1水平顯著高于正常個體，高水平 TGF－β1參與了由于炎癥導致氣道損傷的氣道修復過程，在正常環(huán)境下可促進組織修復、抑制炎癥的發(fā)展。但是，如果氣道受到反復抗原刺激引起持續(xù)的慢性炎癥，就可導致TGF－β1持續(xù)過度增高，從而引起組織纖維化和氣道重建及氣道慢性阻塞［8］。本實驗通過建立不同階段的大鼠慢性哮喘模型，取氣道平滑肌細胞進行原代培養(yǎng)，用不同濃度的 TGF－β1干預細胞生長。研究發(fā)現(xiàn):與對照組 ASMCs相比，兩周及六周哮喘組ASMCs的 G0/G1期細胞所占比例均明顯減少，S期細胞所占比例增高，表明細胞內(nèi)DNA合成明顯增加，處于有絲分裂期的細胞數(shù)目增多。加入不同濃度TGF－β1干預后，與哮喘組相比，兩周及六周哮喘的各干預組 ASMCs的 S期細胞所占比例都明顯增加，即細胞內(nèi)DNA合成增加，處于靜止期和 DNA合成前期的細胞數(shù)目都減少。而且從實驗中觀察到隨著TGF－β1干預濃度的增加，S期細胞所占比例逐漸增多。同時在兩周組和六周組均觀察到，10 μg/L TGF－β1組和 100 μg/L TGF－β1組比 1 μg/L TGF－β1組對ASMCs增殖作用明顯增加，且差別均有統(tǒng)計學意義，但 10 μg/L TGF－β1組和 100 μg/L TGF－β1組相比，ASMCs增殖細胞占細胞總數(shù)的百分比無明顯變化，兩種濃度增殖作用無有明顯差別。用 MTT法觀察到:兩哮喘組 ASMCs的A490值較對照組明顯增高，細胞存活和生長能力明顯增強，兩哮喘組加入各濃度TGF－β1干預后顯示 A490值較各哮喘組均增加，且差別均有統(tǒng)計學意義。但比較兩組流式細胞分析及MTT的結果看，兩周組和六周組相比，加入不同濃度 TGF－β1干預后的差別不大，無統(tǒng)計學意義。實驗結果表明:TGF－β1可使不同階段哮喘大鼠氣道平滑肌細胞增殖增強，處于增殖期的細胞數(shù)目增多。提示TGF－β1對體外培養(yǎng)的哮喘氣道平滑肌細胞早期就有促進增殖的作用。這一結果與TGF－β1在正常大鼠 ASMCs中的促增殖作用相同［9］。TGF－β1在兩周哮喘組和六周哮喘組中均可促進氣道平滑肌細胞增殖增強，顯示 TGF－β1在哮喘發(fā)生的早期變應性炎癥階段即開始起作用［10］。在支氣管和肺部局部高水平表達的TGF－β1可引起呼吸道重塑，而哮喘所激活的許多種細胞都能產(chǎn)生TGF－β1，TGF－β1促進氣道平滑肌細胞和杯狀細胞增生肥大，增加膠原和纖連蛋白合成，并促進其在細胞外基質(zhì)沉積，從而產(chǎn)生導致管腔狹窄和不可逆的肺功能改變等一系列不良后果。阻斷 TGF－β1的作用途徑，有可能達到抑制氣道重建的目的。目前臨床上防治哮喘氣道重塑尚無理想的方法，本課題為哮喘氣道重塑的防治提供了一種新思路，本實驗結果對于我們在哮喘發(fā)生的早期干預氣道重建有一定的幫助。綜上所述，TGF－β1對哮喘的氣道重塑有重要的作用，抑制 TGF－β1在哮喘中的作用可能為哮喘的治療提供一種可供選擇的新方法。

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Effect of TGF-β1on Airway Smooth Muscle Cells Proliferation in Different Periods of Asthmatic Rats

LIN Peng－xiang1，ZHANG Huan－ping2，ZHANG Ai－zhi1
(1.ShanXi Medical University，Taiyuan 030001，China;2.Department of Respiration First Affiliate Hospital of ShanXi Medical University，Taiyuan 030001，China)

Objective To investigate the effect of TGF－β1on airway smooth muscle cells(ASMCs)proliferation in different periods of asthmatic rats.Methods The establishment of 2 week and 6 week rat model of asthma through ovalbumin(OVA)sensitization and excitation.Primary cultures of ASMCs were established for experiments.ASMCs were treated with 1 μg/L，10 μg/L and 100 μg/L TGF－β1.Proliferation of ASMCs was detected by flow cytometry and MTT colorimetric assay.Results The percentage of cells of at S phase and A value of 2 week and 6 week asthmatic ASMCs were(34.31±1.41)%，(35.96±3.46)%，(0.546±0.005)and(0.559±0.009)respectively，significantly increasedcompared with the control group〔(12.24±2.64)%，(0.289±0.009)respectively，(P ＜0.01)〕.The percentage of cells of at S phase and A value of 2 week and 6 week asthmatic ASMCs，which were cultured in different concentration of TGF－β1，were significantly higher than the asthmatic group(P ＜0.01).The percentage of cells of at S phase and A value of 10 μg/L and 100 μg/L TGF－β1group were significantly higher than 1 μg/L TGF－β1group(P ＜ 0.01);and there was no significant change in ASMCs proliferation compared 10 μg/L TGF－β1group with 100 μg/L TGF－β1group(P ＞ 0.05).There was no significant difference in the effect of TGF－β1on ASMCs proliferation between 2 week and 6 week asthmatic model group(P ＞ 0.05).Conclusion Compared with normal rats，the proliferation of ASMCs in different periods of asthmatic rats were obvious and that of 6 week asthmatic model group was more obvious，the percentage of cells at S phase was increasing.And ASMCs in different periods of asthmatic rats were intervened by TGF－β1，the percentage of cells at S phase was increased and the proliferation of ASMCs was enhanced，TGF－β1may contribute to the proliferation of ASMCs in the early stage of asthmatic rats，and significantly promote the proliferation of ASMCs in different periods of asthmatic rats.

Transforming growth factor β1(TGF－β1);Airway smooth muscle cells(ASMCs);Proliferation

R373

A

1671－7856(2010)07－0044－05

2010－03－05

圖1 大鼠氣道平滑肌細胞生長形態(tài)(100x)
Fig.1 GroWth form of rat's ASMCs(100x)

圖2 大鼠氣道平滑肌細胞α-actin 兔疫細胞化學染色(250x)
Fig.2 Immunocytochemical staining of α-actin in ASMCs (250x)

山西省教育廳2005年山西省高?？萍佳芯块_發(fā)項目(NO.20051001)。

藺鵬翔(1980－)，女，碩士生，研究方向:哮喘與肺動脈高壓。E－mail:linpengx@hotmail.com

張煥萍，女，博士，碩士生導師。E－mail:zhp326@163.com