黃 馨，石桂英，陳顯達(dá)，鞠振宇

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

利用流式熒光原位雜交法測(cè)定細(xì)胞端粒長(zhǎng)度

黃 馨，石桂英，陳顯達(dá)，鞠振宇

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的 建立利用流式熒光原位雜交法檢測(cè)細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的技術(shù)方法。方法 以端粒酶敲除的G3小鼠和同齡野生型小鼠為檢測(cè)對(duì)象，分離其外周血中的單個(gè)核細(xì)胞后與肽核酸熒光探針雜交，用流式細(xì)胞儀采集和分析其端粒長(zhǎng)度，分別用熒光原位雜交方法和SYBR Green熒光定量PCR方法驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。結(jié)果 流式熒光原位雜交法測(cè)定G3小鼠細(xì)胞端粒相對(duì)長(zhǎng)度與C57BJ/6野生型小鼠相比為0.5345，熒光定量PCR測(cè)定端粒相對(duì)長(zhǎng)度為0.5717，結(jié)果基本一致。結(jié)論 流式細(xì)胞術(shù)與原位雜交方法結(jié)合起來(lái)檢測(cè)細(xì)胞端粒的平均長(zhǎng)度可靠易行，對(duì)單個(gè)核細(xì)胞端粒平均長(zhǎng)度的檢測(cè)有較高的實(shí)用性。

流式熒光原位雜交法;端粒;PNA探針

端粒是真核生物染色體線性DNA分子末端的特殊結(jié)構(gòu)，通常由簡(jiǎn)單的富含TG的重復(fù)DNA序列及相關(guān)蛋白質(zhì)組成，主要功能是維持染色體的穩(wěn)定性和DNA復(fù)制的完整性。已知端粒縮短是引起細(xì)胞衰老和生物衰老的分子機(jī)制之一，大量與端粒相關(guān)的研究已見諸報(bào)道，而測(cè)量端粒的長(zhǎng)短則成為研究端粒特性的重要手段之一。Rufer［1］首次采用流式熒光原位雜交法(flow fluorescent in situhybrid-ization，F(xiàn)low-Fish)測(cè)定端粒長(zhǎng)度，該法靈敏簡(jiǎn)單，操作快捷，重復(fù)性好。為研究該方法的可行性，本實(shí)驗(yàn)采用Flow-Fish方法對(duì)不同小鼠的端粒長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)定，并通過原位定量熒光雜交(quantitative fluorescent in situ hybridization，Q-Fish)方法和SYBR Green定量RCR方法進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑:肽核酸(Peptide nucleic acid，PNA)探針購(gòu)自韓國(guó) Panagene公司，序列為 CCC TAA CCC TAA CCC TAA，C末端 FITC熒光標(biāo)記;SYBR Green Mix購(gòu)自東洋紡公司;右旋糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:C57BJ/6小鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK-(軍)2007-004］;Terc－/－G3小鼠為本實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房繁殖。

1.1.3 主要儀器:ABI StepOne實(shí)時(shí)定量 PCR儀;BD FACS Aria流式細(xì)胞儀;ZEISS LSM 510 META激光共聚焦顯微鏡。

1.2 試劑配制

1.2.1 紅細(xì)胞裂解液:0.83%NH4Cl，0.22 μm 濾膜過濾后4℃保存;

1.2.2 雜交緩沖液:2mL 100mmol/L Hepes+200 μL10%牛血清白蛋白，加入5%右旋糖至終體積20mL;

1.2.3 染色緩沖液(staining medium，SM):PBS+5%胎牛血清+1%P/S

1.2.4 染色清洗液Ⅰ:341.3mL H2O+32.5mL 1 mol/L Tris pH7.1+16.25mL 10%牛血清白蛋白+16.25mL 10% 吐溫20+1218.8mL甲酰胺，混勻后分裝至1.5mL離心管，－20℃保存不超過2個(gè)月;

1.2.5 染色清洗液Ⅱ:374mL 5%右旋糖+42.5mL 100mmol/L Hepes+4.25mL 10%牛血清白蛋白+4.25mL 10%吐溫20，混勻后分裝至1.5mL離心管，4℃保存不超過2個(gè)月;

1.2.6 雜交混合液:PNA探針溶解于H2O和二甲基甲酰胺的等體積混合液，濃度為1 μg/μL(如不能充分溶解，可在50℃～80℃加熱片刻);在50mL離心管內(nèi)加入40.5mL去離子甲酰胺+1.08mL 1 mol/L Tris pH7.1+7.92mL H2O，充分混勻后各取24.25mL轉(zhuǎn)移至另兩個(gè)50mL離心管內(nèi)，一個(gè)管加入 750 μL 1 μg/μL PNA 探針溶液輕輕搖晃混勻，另一個(gè)管加入750 μL H2O/二甲基甲酰胺混合液混勻作為空白對(duì)照;在干凈燒杯中加入3.72mL H2O+1.67mL 1 mol/L Tris pH7.1+1.67mL 1 mol/L NaCl+8.37mL 10%牛血清白蛋白+62.7mL去離子甲酰胺，充分混勻后各取38.6mL轉(zhuǎn)移至另外兩個(gè)燒杯中，分別標(biāo)記為“unst”和“tel”，在 unst管中加入413 μL空白對(duì)照，在 tel管中加入413 μL PNA探針稀釋液，充分混勻后分別轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，每管190 μL體積，－20℃保存不超過2個(gè)月;

1.3 準(zhǔn)備小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞

從小鼠尾部取外周血約 100 μL，加入 10 μL 0.1mmol/L EDTA抗凝;快速加入冰冷的0.83%NH4Cl 1mL，反復(fù)吹打混勻，室溫放置10 min;2000 r/min離心5 min，小心棄上清;用SM調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，分裝至0.2mL PCR管中，每管 2×105個(gè)細(xì)胞;

1.4 雜交和抗體標(biāo)記

裝有細(xì)胞的 PCR管2000 r/min離心5 min，小心棄上清，使剩余液體體積在10 μL左右，用槍頭吹打混勻;每管中分別加入170 μL雜交混合液或空白雜交混合液，吹打混勻后室溫孵育10 min;將PCR管移至87℃水浴中孵育15 min，取出后室溫避光孵育120 min;將細(xì)胞懸浮液從PCR管中移至裝有900 μL染色清洗液Ⅰ的1.5mL離心管中，吹打混勻，于16℃以4000 r/min離心5 min;小心棄上清，使剩余液體體積在100 μL左右(液體過少的話容易丟失細(xì)胞)，吹打混勻;加入 1000 μL 染色清洗液 I，于16℃以4000 r/min離心5 min;小心棄上清，余100 μL液體;重復(fù)此步驟2次;將剩余液體吹打混勻，加入1000 μL染色清洗液Ⅱ，于16℃以2000 r/min離心5 min;小心棄上清，使剩余液體體積在20 μL左右;加入300 μL SM，吹打混勻后冰上孵育60 min。

1.5 流式細(xì)胞儀分析

采用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的FACS Aria型流式細(xì)胞儀，激發(fā)光源為氬離子激光，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，檢測(cè)FITC熒光強(qiáng)度。端粒熒光定量即Flow-Fish值為實(shí)驗(yàn)樣品平均熒光強(qiáng)度。

1.6 Q-Fish方法測(cè)定端粒長(zhǎng)度

同上制備小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液，用SM調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，分裝至0.2mL PCR管中，每管2×105個(gè)細(xì)胞;裝有細(xì)胞的PCR管2000 r/min離心5 min后，小心棄上清，使剩余液體體積在10 μL左右，用槍頭吹打混勻;每管細(xì)胞加入100 μL新鮮配制的冰醋酸溶液(3∶1)，充分混勻;用無(wú)水乙醇清洗載玻片，干燥后用冰醋酸溶液處理，空氣干燥;每個(gè)載玻片置一滴細(xì)胞懸液，67℃溫箱孵育10 min;載玻片在PBS中浸洗15 min，轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛中固定4 min;用PBS浸洗兩次，每次3 min;依次在70%、85%和100%冰乙醇中浸洗1 min以脫水;室溫晾干;每張載玻片加15 μL雜交混合液，覆上蓋玻片;80℃變性5 min;室溫避光孵育2 h;室溫下在染色清洗液Ⅰ中浸洗片刻以除去蓋玻片，染色清洗液Ⅰ中57℃孵育20 min;室溫下在染色清洗液Ⅱ中浸洗1 min;取出后稍晾干，每個(gè)載玻片加一滴SM，封片;激光共聚焦顯微鏡掃描，用488 nm激光器激發(fā)綠色熒光，掃描分辨率為1024×1024 pixel，計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集，數(shù)字成像。

1.7 SYBR Green定量PCR方法測(cè)定端粒長(zhǎng)度

1.7.1 引物序列:端粒上游引物(tel1):5′-C GGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGT T-3′，下游引物 (tel2):5′-GGCTTGCCTTACCCT TACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3′，Hbg 基因上游引 物:5′-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3′，下游引物:5′-CACCAACTTCATCCACGTTCACC-3′。

1.7.2 樣品的制備:將小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)和電泳定質(zhì)定量后，稀釋為20 ng/μL，－20℃保存?zhèn)溆?

1.7.3 PCR的條件:95℃ 10 min激活Taq酶，開始循環(huán):95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。在60℃時(shí)檢測(cè)熒光。

1.7.4 數(shù)據(jù)收集和分析:主要由ABI StepOne實(shí)時(shí)定量PCR儀自帶軟件完成。通過軟件可以計(jì)算出所有樣品的熒光起始循環(huán)數(shù)(CT)。由于每經(jīng)過1個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物量翻倍，T/S比率為［2CT(telomere)/2CG(Hbg)］－1=2－△CT，相對(duì) T/S 比率(一樣品相對(duì)于另一樣品的 T/S)為－2－(△CT1－CT2)=2－△△CT。根據(jù)此公式可計(jì)算出每個(gè)樣本的相對(duì)T/S值，該值與樣品DNA的相對(duì)端粒長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀的分析結(jié)果

Terc－/－G3小鼠細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度為 1216，空白對(duì)照為247;野生型C57BJ/6小鼠細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度為2034，空白對(duì)照為224。經(jīng)計(jì)算，其差值分別為969和1813。設(shè)定野生型C57BJ/6小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞端粒長(zhǎng)度為 N，則 Terc－/－G3小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞端粒相對(duì)長(zhǎng)度為0.5345N(圖1)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞端粒長(zhǎng)度Fig.1 Calculation of telomere length from flow Fish data

2.2 激光共聚焦顯微鏡成像結(jié)果

結(jié)果顯示野生型C57BJ/6小鼠細(xì)胞端粒染色后熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于Terc－/－G3小鼠(圖2)。

2.3 定量PCR結(jié)果

設(shè)定野生型C57BJ/6小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞端粒長(zhǎng)度為 N，如圖3所示，其△CT值為11.0039，G3小鼠的△CT值為9.9988。根據(jù)公式［2CT(telomere)/2CG(Hbg)］－1=2－△CT和－2－(△CT1－CT2)=2－△△CT，可計(jì)算出Terc－/－G3小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞端粒相對(duì)長(zhǎng)度為0.5717N。

圖2 小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度檢測(cè)結(jié)果(綠色熒光)(FISH×400)Fig.2 Calculation of telomere length from Q-Fish data(green fluorescence)(FISH×400)

圖3 小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的定量PCR熒光曲線圖Fig.3 Amplification curve of fluorescence quantitative PCR of mice blood DNA

3 討論

已知端粒是由高度重復(fù)序列 TTAGGG組成［2］，其長(zhǎng)度越長(zhǎng)，在 FISH中結(jié)合的熒光素標(biāo)記的(CCCTAA)3PNA探針就越多，熒光強(qiáng)度越大。QFish中應(yīng)用了熒光素連接的肽核酸探針與細(xì)胞分裂中期的染色體端粒重復(fù)序列雜交，鏡下的每一個(gè)端粒點(diǎn)都與相應(yīng)的端粒長(zhǎng)度相關(guān)，可用軟件分析其熒光強(qiáng)度從而得到其端粒相對(duì)長(zhǎng)度。由于Q-Fish技術(shù)需要分裂中期的細(xì)胞標(biāo)本，并且不能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行選擇和分型，在一定程度上限制了其應(yīng)用。Flow-Fish技術(shù)的主要特點(diǎn)是將流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)和熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)結(jié)合起來(lái)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度即可表示端粒長(zhǎng)度。本實(shí)驗(yàn)中所選用的Terc－/－G3小鼠是敲除了端粒酶 RNA組分(telomerase RNA component，TERC)的模型小鼠。其后代表現(xiàn)出以約3－5kb的速率進(jìn)行性端?？s短［3］。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得所用Terc－/－G3小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞端粒長(zhǎng)度明顯短于正常野生型C57BJ/6小鼠，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。

端粒長(zhǎng)度測(cè)定的經(jīng)典方法是 Southern印跡法［4］，即通過DNA印跡雜交方法測(cè)定端粒限制性片段長(zhǎng)度(telomere restriction fragment length，TRFL)，從此得到樣品中有核細(xì)胞的所有染色體的平均端粒長(zhǎng)度。Southern方法操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，而且需要大量樣品。另外由于實(shí)驗(yàn)近交系小鼠細(xì)胞端粒長(zhǎng)達(dá)10～40 kb，瓊脂糖凝膠電泳時(shí)難以得到分離較好的DNA條帶，直接影響了結(jié)果判讀。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是通過使用針對(duì)擴(kuò)增DNA的熒光物質(zhì)，使DNA數(shù)量與檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系，得到DNA的S型擴(kuò)增曲線。Cawthon等［5］研究表明用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定的端粒長(zhǎng)度與Southern雜交所測(cè)定的端粒長(zhǎng)度顯著相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)室的前期研究也證明了這一點(diǎn)［6］。因此在用 Flow-Fish方法測(cè)定不同小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞端粒長(zhǎng)度后，我們又用Q-Fish方法和RT-PCR方法對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明用Flow-Fish方法測(cè)定的端粒長(zhǎng)度與后兩種方法所測(cè)定的端粒長(zhǎng)度基本一致，這說明我們建立的Flow-Fish檢測(cè)端粒長(zhǎng)度的方法是可靠的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定可行的檢測(cè)細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的Flow-Fish實(shí)驗(yàn)方法，本方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，適用于單個(gè)核細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的檢測(cè)。

［1］Rufer N，Dragowska W，Thornbury G，et al.Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry［J］.Nat Biotechnol，1998，16:743－747.

［2］Blackburn EH.Telomeres［J］.Trends Biochem Sci，1991，16:378－381.

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［5］Cawthon RM.Telomere measurement by quantitative PCR［J］.Nucleic Acids Res，2002，30:e47.

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Flow-Fish to Measure the Average Length of Telomeres

HUANG Xin，SHI Gui-ying，CHEN Xian-da，JU Zhen-yu
(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS)＆ Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical College(PUMC);Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health，Beijing 100021，China)

Objective To test the Flow fluorescent in situ hybridization(Flow-Fish)method for measuring the length of telomeres.Methods The peripheral blood mononuclear cells were separated from 3rd generation telomerase knockout mice and wild-type mice.Cells were hybridized with PNA fluorescent probe and their telomere length was analyzed by flow cytometry.To confirm the Flow-Fish method we compared the measurement of telomere length obtained with the Flow-Fish method with that determined with conventional SYBR Green fluorescence quantitative PCR assay and QFish method.Results The relative telomere length measured by Flow-Fish was 0.5345，which was accordant to the results measured by fluorescence quantitative PCR assay(0.5717).Conclusion These results show that Flow-Fish can be used to measure specific nucleotide repeat sequences in single cells efficiently and easily.

Flow fluorescent in situ hybridization(Flow-Fish);Telomere;PNA probe

R-33

B

1671-7856(2010)07-0067-05

2010-04-09

十一五新藥專項(xiàng)支持(2009zx09501-026);國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30771189)。

黃馨(1979-)，博士生，研究方向:分子細(xì)胞生物學(xué)。

鞠振宇，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向:分子細(xì)胞生物學(xué)。E-mail:zhenyuju@hotmail.com