陳十燕，陳賢明，，羅 萍，肖 麗

(1.福建醫(yī)科大學(xué)福州總醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院，福州 350025;2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科，福州 350025)

D－半乳糖建造老年性聾動(dòng)物模型

陳十燕1，陳賢明1，2，羅 萍2，肖 麗2

(1.福建醫(yī)科大學(xué)福州總醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院，福州 350025;2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科，福州 350025)

目的 研究D－半乳糖建造老年性聾模型的理想方式。方法 健康wistar大鼠50只，隨機(jī)分為5組，即對(duì)照組和四個(gè)不同劑量D－半乳糖(50、100、200、500 mg/kg)建造的老年性聾模型組。觀察各組動(dòng)物行為檢測(cè)(興奮性實(shí)驗(yàn))、ABR反應(yīng)閾、血清中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性、聽(tīng)皮層中的神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量。結(jié)果 各模型組較對(duì)照組探究能力明顯下降，但緊張度無(wú)明顯改變。血清中MDA含量和SOD活性與對(duì)照組比較有顯著性升高(P＜0.05)，但 ABR閾值和Ⅰ、Ⅲ波潛伏期僅500 mg/kg組顯著升高延長(zhǎng)，其他模型組與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異。并且模型組中僅500 mg/kg組聽(tīng)皮層出現(xiàn)明顯的神經(jīng)細(xì)胞稀少、腫脹，尼氏小體減少的現(xiàn)象。結(jié)論 D－半乳糖(500 mg/kg)腹腔注射每天一次持續(xù)10周造模是建造老年性聾動(dòng)物模型的有效方法。

wistar大鼠;老年性聾;D－半乳糖;模型，動(dòng)物

老年性聾是指因年齡的增長(zhǎng)，聽(tīng)覺(jué)器官隨同身體其他組織器官一起所發(fā)生的緩慢進(jìn)行性老化過(guò)程，并出現(xiàn)聽(tīng)力減退的生理現(xiàn)象。它是自然老化過(guò)程，聽(tīng)力損失以高頻為主。在老年性聾的實(shí)驗(yàn)研究中，國(guó)內(nèi)外多是采用經(jīng)臨床證實(shí)的人類(lèi)老年性聾患者及自然衰老的動(dòng)物，以老年性聾模型作為研究對(duì)象并不多見(jiàn)。用人類(lèi)老年性聾患者和自然衰老的動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象具有一定的局限性，一是研究對(duì)象不容易獲取，而且樣本量收集的時(shí)間較長(zhǎng)。二是在病理方面研究其發(fā)展變化用人類(lèi)老年性聾患者是不可行的，所以制備老年性聾動(dòng)物模型是很有必要的。國(guó)內(nèi)有多家學(xué)者提出D－半乳糖構(gòu)建老年性聾動(dòng)物模型，但其動(dòng)物的選取、給藥的方式、劑量和時(shí)間有很大差異。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同劑量D－半乳糖建造老年性聾模型并對(duì)該造模條件進(jìn)行比較，為老年性聾的研究提供一個(gè)可靠、簡(jiǎn)便易行的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

選用耳廓反射靈敏的健康Wistar大鼠(月齡2～3個(gè)月)50只，體重180～200 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供［SCXK(滬)2007－0005］。D－半乳糖購(gòu)于Sanland公司。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。甲苯胺藍(lán)購(gòu)于 Amresco公司。50只大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，即對(duì)照組和四個(gè)不同劑量D－半乳糖(50、100、200、500 mg/kg)腹腔注射建造的老年性聾模型組。對(duì)照組(甲組)腹腔注射等體積的生理鹽水作為對(duì)照，模型組(4種劑量分別為 MG1，MG2，MG3和MG4)每天一次，持續(xù)10周。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 興奮性實(shí)驗(yàn)［1］:利用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分析。觀察小鼠在5 min內(nèi)跨格次數(shù)、站立次數(shù)、排便粒數(shù)和小便的次數(shù)?？绺翊螖?shù)和扶墻站立次數(shù)反映興奮性，排便粒數(shù)和小便次數(shù)反映緊張反射情況。

1.2.2 ABR反應(yīng)閾檢測(cè):美國(guó)intelligent hearing聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試。1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg行腹腔注射麻醉，待麻醉滿(mǎn)意后在具有良好隔音室內(nèi)(環(huán)境溫度25℃ ±3℃)。耳塞置于外耳道內(nèi)。用針灸銀針作電極，將電極分別置入顱頂及雙側(cè)乳突皮下深達(dá)骨膜，顱頂為記錄電極，參考電極在測(cè)試耳乳突部，對(duì)側(cè)耳乳突部為接地電極。刺激參數(shù):刺激聲為時(shí)程100 s的方波脈沖短聲(click)，帶通濾波100～3000 Hz，掃描時(shí)程10 ms，掃描平均疊加1024次，增益10000倍，短聲刺激重復(fù)率為11次/s，刺激強(qiáng)度從90 dB開(kāi)始，5 dB一檔次遞減，以Ⅲ波為標(biāo)志波確定閾值。再以80 dB的刺激強(qiáng)度測(cè)試大鼠的各波潛伏期和波間期。取每只大鼠右耳結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.3 血清中的MDA和SOD檢測(cè):各組動(dòng)物在用藥前和用藥后分別采靜脈血2mL，室溫下靜置30 min，于4℃下3500 r/min離心10 min，取上層血清置－20℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)錅y(cè)。測(cè)試的過(guò)程嚴(yán)格按照測(cè)試盒上的說(shuō)明進(jìn)行操作。分別計(jì)算出SOD活力和MDA的濃度。

1.2.4 聽(tīng)皮層石蠟切片:動(dòng)物麻醉，開(kāi)胸，經(jīng)左心室灌注生理鹽水，沖凈血液，隨后用4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，然后開(kāi)顱解剖定位并取下聽(tīng)皮層，固定后石蠟包埋切片，每張切片的厚度為6 μm，進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。觀察其神經(jīng)元的形態(tài)和數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0等統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)值用(±s表示，五組之間進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 興奮性實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組其探究活動(dòng)(爬格數(shù)和扶墻次數(shù))明顯減少(P＜0.05)，但其緊張度(大小便)無(wú)明顯變化(P ＞0.05)(表1)。

表1 D－半乳糖各不同劑量興奮性實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)比較(n=10)Tab.1 Comparison of four excitatory experiment indexes in different groups(n=10)

2.2 血清中MDA和SOD檢測(cè)結(jié)果

MG1、MG2、MG3、MG4 四組 SOD 活性較甲組均有不同程度下降(P＜0.05)。其中 MG1、MG2、MG3三組之間差異不顯著 (P ＞0.05)。MG4組SOD活性最低，與其余各組相比均有顯著性差異(P ＜0.05)。MG1、MG2、MG3、MG4 四組 MDA 較CG組均有不同程度下降(P ＜0.05)。其中 MG1、MG2、MG3三組之間差異不顯著 (P ＞0.05)。MG4組MDA最高，與其余各組相比均有顯著性差異 (P＜0.05)(表2)。

表2 D－半乳糖各不同劑量組SOD(U/mgprot)活性和MDA(nmol/mgprot)的濃度比較(n=10)Tab.2 Comparison of the activity of SOD and the level of MDA in serum in different groups(n=10)

2.3 ABR檢測(cè)結(jié)果

MG1、MG2、MG3、MG4 四組 ABR 反應(yīng)閾、Ⅰ、Ⅲ波潛伏期和Ⅰ—Ⅲ波間期較CG組均有不同程度升高和延長(zhǎng)，但其CG、MG1、MG2、MG3四組組間差異不顯著(P ＞0.05)，MG4組不僅ABR反應(yīng)閾明顯升高，且I、III波潛伏期和波間期較 CG、MG1、MG2、MG3各組差異均有顯著性差異 (P＜0.05)(表3)。

2.4 甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果

光鏡下見(jiàn) CG、MG1、MG2、MG3四組中大鼠聽(tīng)皮層神經(jīng)細(xì)胞密集，染色均勻，尼氏體正常，胞核和胞質(zhì)極少有皺縮和空泡樣變。膠質(zhì)細(xì)胞正常。MG4組中聽(tīng)皮層神經(jīng)元數(shù)明顯減少(P＜0.05)，神經(jīng)細(xì)胞腫脹，胞核和胞質(zhì)濃縮，尼氏體減少(表4，圖1，見(jiàn)彩插3)。

表3 D－半乳糖各不同劑量組ABR檢測(cè)結(jié)果比較(n=10)Tab.3 Comparison of the results of ABR detection in different groups(n=10)

表4 D－半乳糖各不同劑量組聽(tīng)皮層神經(jīng)元數(shù)比較(n=10)Tab.4 Comparison of the number of neurons in different groups(n=10)

3 討論

D－半乳糖致衰老模型是由中國(guó)學(xué)者［2］在 20世紀(jì)80年代末期建立并應(yīng)用于老年醫(yī)學(xué)研究的，該模型在建立的初期主要是用于老年性白內(nèi)障的研究，在后續(xù)的研究中越來(lái)越多的證據(jù)表明，D－半乳糖的致代謝紊亂作用不僅作用于眼晶體，其他部位如視網(wǎng)膜、肝、腦、耳等組織也會(huì)出現(xiàn)一系列的退行性改變。國(guó)內(nèi)已有學(xué)者提出以D－半乳糖誘導(dǎo)豚鼠發(fā)生衰老，可以在內(nèi)耳產(chǎn)生老年性聾的病理改變［3］。D－半乳糖在體內(nèi)可氧化產(chǎn)生大量自由基，使機(jī)體抗氧化酶活力下降，過(guò)氧化產(chǎn)物累積，還可以造成組織細(xì)胞內(nèi)半乳糖醇堆積，影響正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能障礙，代謝紊亂。還有研究發(fā)現(xiàn) D－半乳糖具有降低細(xì)胞增殖能力，加速細(xì)胞老化作用。最終加速機(jī)體衰老，并誘導(dǎo)體內(nèi)多器官發(fā)生衰老性疾?。?］。

老年性聾動(dòng)物模型動(dòng)物品種的選擇有豚鼠、SD大鼠、Wistar大鼠，給藥途徑有口服、眼球后、頸部皮下和腹腔注射給藥，給藥的時(shí)間有4周、6周、8周等。在動(dòng)物品種方面，豚鼠的聽(tīng)覺(jué)較 SD大鼠和Wistar大鼠敏感，常用于聽(tīng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)方面的研究，但其飼養(yǎng)成本較高，并由于其聽(tīng)覺(jué)的特殊性不宜普遍推廣。在給藥途徑方面，口服是將D－半乳糖混入飼料中每日定時(shí)定量喂養(yǎng)，這種方法過(guò)于理想化，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的準(zhǔn)確度把握較差。眼球后注射操作方法較為復(fù)雜，并容易操成局部損傷，而皮下注射方法較為簡(jiǎn)單，但易在局部形成腫塊不宜吸收。另外，傳統(tǒng)的造模方法所需時(shí)間只要4～6周，但本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)劑量下(50 mg/kg～100 mg/kg)6周左右并未發(fā)現(xiàn)大鼠的聽(tīng)力(ABR反應(yīng)閾，Ⅰ—Ⅲ波的潛伏期和波間期)有顯著性的變化。本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)對(duì)Wistar大鼠在不同劑量D－半乳糖的連續(xù)腹腔注射10周后，觀察其是否符合老年性聾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)前后所有大鼠并無(wú)因給藥而出現(xiàn)死亡、體重異常改變的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在6～8周時(shí)均出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、進(jìn)食少、體形消瘦、反應(yīng)差等形體衰老現(xiàn)象。結(jié)合興奮性試驗(yàn)結(jié)果分析可知，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物都出現(xiàn)不同程度的衰老變化，但ABR反應(yīng)閾在此期間并無(wú)明顯變化。10周后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中僅500 mg/kg其他各組之間差異有顯著性組，出現(xiàn)聽(tīng)力下降(P＜0.05)，并且其血清中的SOD活性和MDA的濃度較其他各實(shí)驗(yàn)組之間差異有顯著性，而其他實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)顯著性差異。結(jié)果表明一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)給藥可以使大鼠發(fā)生衰老變化，但衰老并不一定就有聽(tīng)力下降的表現(xiàn)，這可能與給藥時(shí)間長(zhǎng)短、給藥的劑量存在的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)證實(shí) D－半乳糖500 mg/kg的劑量每日一次是可以被機(jī)體接受的，并可以產(chǎn)生顯著的聽(tīng)力下降，是切實(shí)可行的造模方法。

老年性聾不僅表現(xiàn)為內(nèi)耳病理形態(tài)學(xué)改變，聽(tīng)覺(jué)中樞神經(jīng)系統(tǒng)亦可發(fā)生退行性變，聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路和皮層中神經(jīng)核團(tuán)內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞萎縮，數(shù)量減少，甚至發(fā)生核固縮［5］。本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)組大鼠聽(tīng)皮層觀察到其神經(jīng)元計(jì)數(shù)明顯少于對(duì)照組，并且其形態(tài)上也發(fā)生顯著改變，與文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)一致。有學(xué)者［6］在通過(guò)比較3月齡和36月齡大鼠發(fā)現(xiàn)老年大鼠的聽(tīng)皮層的厚度較成年大鼠減少46%左右，且神經(jīng)元胞體，樹(shù)突的結(jié)構(gòu)和形態(tài)均有改變。在其他的一些研究中發(fā)現(xiàn)18月齡的Wistar大鼠較3月齡的聽(tīng)皮層的細(xì)胞凋亡率顯著升高，從而造成聽(tīng)皮層的功能減退而出現(xiàn)聽(tīng)力下降［7］。D－半乳糖長(zhǎng)期應(yīng)用可以使機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量的氧自由基。氧自由基不僅能激活細(xì)胞凋亡基因，使細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，而且能直接損傷 DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)還能影響核基因轉(zhuǎn)錄，改變細(xì)胞的表型特征，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。SOD則是體內(nèi)重要的自由基清除劑，是生物體防御活性氧和其他氧自由基傷害的酶［8］。有研究表明由D－半乳糖所造成大鼠氧化損傷的機(jī)制與自然衰老大鼠是相一致的，都是通過(guò)減低SOD基因轉(zhuǎn)錄水平從而導(dǎo)致 SOD蛋白表達(dá)水平降低［9］。另外，SOD還與某些凋亡基因有著密切關(guān)系。腫瘤壞死因子(TNF)可引起許多腫瘤或非腫瘤細(xì)胞的凋亡，TNF可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的SOD能抑制它所引起的細(xì)胞凋亡，當(dāng)SOD水平下降時(shí)，細(xì)胞對(duì)TNF的敏感性升高，造成細(xì)胞的凋亡率上升［10］。在大鼠聽(tīng)皮層、蝸核、耳蝸組織中氧自由基產(chǎn)生增多，同時(shí)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)功能下降，產(chǎn)生與清除之間出現(xiàn)顯著失衡，發(fā)生氧化損傷和誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)細(xì)胞受到損害和減少，而導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)功能障礙［11］。本實(shí)驗(yàn)對(duì) D－半乳糖建立老年性聾模型進(jìn)行研究，為老年性聾的研究提供－個(gè)可靠、簡(jiǎn)便易行的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

［1］Xu XH，Zhao TQ.Effects of puerarin on D－galactose induced memory deficits in mice［J］.Acta Pharmacol Sin，2002，23(7):587－590.

［2］Song X，Bao M，Li D，et al.Advanced glycation in D－galactose induced mouse aging mode1［J］.Mech Ageing Dev，1999，108(3):239－251.

［3］崔旭，李文彬，張炳烈，等.自由基損傷與 D－半乳糖所致細(xì)胞老化關(guān)系［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2000，20(1):24－26.

［4］Ho SC，Liu JH，Wu RY.Establishment of the mimetic aging effect in mice caused by D－galactose［J］.Biogerontology，2003，4(1):15－18.

［5］Gates GA，Mills JH.Presbycusis［J］.Lancet，2005，366(9491):1111－1120.

［6］Ouda L，Nwabueze－Ogbo FC，Druga R，et al.NADPH－diaphorasepositive neurons in the auditory cortex of young and old rats［J］.Neuroreport，2003，14(3):363－366.

［7］彭斌，周媛，謝鼎華.增齡對(duì)年齡相關(guān)性聽(tīng)力減退大鼠聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)通路形態(tài)學(xué)的影響［J］.中國(guó)耳鼻咽喉顱底外科雜志，2008，14(2):103－106.

［8］方允中，鄭榮梁.自由基生物學(xué)的理論和應(yīng)用［M］.北京:科學(xué)出版社，2002:366－381.

［9］Takahashi R，Komiya Y，Goto S.Effect of dietary restriction on learning and memory impairment and histologic alterations of brain stem in senescence－accelerated mouse(SAM)P8 strain［J］.Ann NY Acad Sci，2006，1067:388－393.

［10］Tsujisaki M，Hinodo Y，Tosuchi S，et al.The analysis of internal age－bearing anti－idiotyPic monodlonal antibody in relation to cartinoembryonic antigen［J］.J Immunol，1993，2(150):508－5166.

［11］Troy CM.Shelanski Ml. Down－regulation of copper/zine superoxide dismutase acauses apoptotic death in PC120 neuronal cells［J］.Proc Nat1 Acad Sci USA，1994，91:6384.

Model Establishment of Presbycusis by D-galactose

CHEN Shi－yan1，CHEN Xian－ming1，2，LUO Ping2，XIAO Li2
(1.Clinical Medicine School，F(xiàn)uzhou General Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350025，China;2.Department of Otolaryngology－Head and Neck Surgery，F(xiàn)uzhou General Hospital of PLA，F(xiàn)uzhou 350025，China)

Objective To find an ideal way for model establishment of presbycusis by D－galactose.Methods Fifty wistar rats were randomly divided into five groups，including one control group(CG)and four model groups(model group 1∶MG1，model group 2∶MG2，model group 3∶MG3 and model group 4∶MG4)with different dosages of D－galoctose(50 mg/kg，100 mg/kg，200 mg/kg，500 mg/kg).Then，we observed in each group the changes in animal behavior(excitatory experiment)，in ABR，and in the activity of SOD and the level of MDA in serum，as well as morphological and quantitative changes in auditory cortex neurons.Results Compared with the control group，no visible changes of tensity were observed，while the ability of exploration obviously decreased，and the activity of SOD and the level of MDA in serum significantly increased(P＜0.05)in the four model groups.However，only in MG4，latency of waveⅠ andⅢ and threshold of ABR were significantly delayed and elevated when compared with the control group.In addition，significant morphological changes in auditory cortex could also be seen in MG4，such as scarcely distributed neurons，swollen bodies of neurons，and reduced number of Niss＇s bodies.Conclusion It is an effective method for the model preparation of presbycusis by intraperitoneally injection of wistar rat by 500 mg/kg D－galactose every day for 10 weeks.

Wistar rat;Presbycusis;D－galactose;Model，animal

R764.436

A

1671－7856(2010)07－0017－04

2010－03－02

圖1 甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果
Fig.1 Results of auditory cortex section stained by toluidine blue
注：a:對(duì)照組； b:模型組 2； c: 模型組 4。
Note: a: Control group; b: Model group 2; c: Model group 4.

福建省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2009Y0041)。

陳十燕(1985－)，男，碩士生，研究方向:耳聾的基礎(chǔ)和臨床研究。E－mail:Chenshiyan0207@163.com

陳賢明。E－mail:fzchxming@sina.com