盧 斌，王 堅，孫玲君，王 群，李 潔，王揚天，胡蘭萍

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院內(nèi)分泌科，南京 210002)

五味子對實驗性水上漂浮及高強度運動大鼠垂體－性腺軸的影響

盧 斌，王 堅，孫玲君，王 群，李 潔，王揚天，胡蘭萍

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院內(nèi)分泌科，南京 210002)

目的 研究五味子對實驗性水上漂浮及高強度運動大鼠垂體－性腺軸的影響。方法 34只SD大鼠隨機分為非應(yīng)激對照組(A組，n=10)、應(yīng)激對照組(B組，n=12)和五味子干預(yù)組(C組，n=12)。A組不接受任何刺激，在生理鹽水灌胃1周后進行取樣。B組和C組進行為期10 d的遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練，分別用生理鹽水和五味子灌胃1周后，行3 h水上漂浮及3 h跑臺高強度運動，結(jié)束即刻取血，測定血清皮質(zhì)酮(CORT)、睪酮(T)、黃體生成素(LH);隨機取一側(cè)睪丸，HE染色觀察組織病理結(jié)構(gòu);電子顯微鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果(1)B組大鼠與A組相比，睪酮水平顯著下降;C組大鼠與B組相比，睪酮水平無明顯變化，皮質(zhì)酮水平顯著降低;黃體生成素在3組之間均無顯著變化。(2)HE染色示3組大鼠睪丸組織病理無明顯變化。(3)電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，B組大鼠睪丸Leydig細(xì)胞線粒體腫脹，電子密度增高;C組大鼠睪丸Leydig細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)趨向于正常，可見分泌顆粒。結(jié)論五味子對實驗性水上漂浮及高強度運動大鼠睪酮水平無明顯作用，對睪丸超微結(jié)構(gòu)有一定保護作用。

五味子;水上漂浮;高強度運動;睪酮;皮質(zhì)酮;大鼠

應(yīng)激反應(yīng)是個體對環(huán)境變化所做出的適應(yīng)，但過度和失衡狀態(tài)的持續(xù)會引起軀體功能的紊亂和疾病的發(fā)生。有關(guān)應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生機制及其調(diào)節(jié)因素的研究受到廣泛關(guān)注，其中中草藥對機體應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)成為相關(guān)研究的重點。本研究通過五味子對實驗性水上漂浮和高強度運動大鼠的干預(yù)，觀察大鼠性激素水平的變化，睪丸組織病理學(xué)改變，探討五味子對應(yīng)激大鼠下丘腦－垂體 －性腺(HPG)軸的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

五味子購自南京金陵大藥房，粉碎后置于清水中浸泡20 min，加熱至沸騰，回流30 min，過濾并濃縮，使其質(zhì)量濃度相當(dāng)于原藥1g/mL。T、LH、CORT放射免疫分析藥盒購自北京市福瑞生物工程公司。

1.2 實驗動物與分組

清潔級雄性SD大鼠，鼠齡6周，體重120～150 g，共24只，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供。動物合格證號:SCXK－(軍)2007－0102。試驗前在清潔級動物飼養(yǎng)中心以標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物維持期飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進食和飲水，室內(nèi)溫度為(20～24)℃，濕度50%～70%，12 h光照與12 h暗夜交替。大鼠隨機分為3組:非應(yīng)激對照組(A組，n=10)、應(yīng)激對照組(B組，n=12)和五味子干預(yù)組(C組，n=12)。實驗過程中 A組不接觸任何應(yīng)激源，B組、C組大鼠的籠子每天晚上8點開始與土貓的籠子并排放置，使大鼠從視覺、聽覺和嗅覺上受到土貓的刺激，大鼠和土貓之間無直接接觸，每天12 h，共10 d，造成慢性心理應(yīng)激模式。各組大鼠均自由飲食飲水。C組按照2.25 g/kg體重，每天2次，用五味子水煎液灌胃;A組、B組用同體積的生理鹽水灌胃，灌胃共1周。

1.3 實驗過程

B組、C組大鼠參照 Bedford［1］跑臺訓(xùn)練方法進行為期10 d的訓(xùn)練，首先兩組大鼠進行3 d適應(yīng)性訓(xùn)練，跑臺坡度0°，速度15 m/min，每天訓(xùn)練歷時15 min，之后隔天訓(xùn)練 1次，跑速逐漸增加 26.8 m/min，訓(xùn)練時間逐漸增加至60 min，最后兩次坡度由0°改為5°，總共訓(xùn)練10 d。適應(yīng)性訓(xùn)練3 d后，C組按照2.25 g/kg體重，每天2次，用五味子水煎液灌胃;A組、B組用同體積的生理鹽水灌胃，灌胃共1周。實驗第11天晨8點將B組、C組大鼠置于木制船模型(1.4×0.8×0.4)m，由泰興市竹泓縣慶雷木船廠定制)中。船模型漂浮于長方體的充氣水池內(nèi)，水池右側(cè)有一根據(jù)造浪球原理設(shè)計的電動機械造浪裝置，使船前后左右搖擺±20°。大鼠在水上漂浮歷時3 h，期間禁食水。結(jié)束后兩組大鼠立即進行跑臺高強度運動，期間繼續(xù)禁食水。按照 Bedford等運動強度與最大耗氧量關(guān)系的研究，大鼠運動強度定為:坡度為5°，速度為26.8 m/min。歷時3 h。若跑臺運動時大鼠提前出現(xiàn)力竭癥狀，即不能堅持負(fù)荷跑速，滯留跑道后1/3處達3次以上，刺激驅(qū)趕無效，則提前處死。

1.4 取材

實驗結(jié)束，采用氯胺酮(10 mg/100 g)腹腔麻醉，沿腹正中線剪開腹壁，橫膈，暴露心臟，細(xì)針穿刺心臟靜脈竇取血5mL，置于加有40 μL抑肽酶的離心管內(nèi)，室溫下2 500 r/min離心20 min，制備血清，－20℃保存，用于測定 CORT、T、LH水平。分離睪丸，用蒸餾水沖洗睪丸3次后取新鮮組織約1mm3，置于2.5%戊二醛固定并放置4℃冰箱冷藏，剩余睪丸組織置于甲醛固定液中。

1.5 血清激素測定與睪丸超微結(jié)構(gòu)觀察

用放射免疫方法檢測大鼠血清T、LH、CORT水平，檢測方法參照試劑盒說明。取出4℃中性緩沖甲醛固定好的睪丸，取材，石蠟包埋，常規(guī)切片，切片厚度4 μm，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察睪丸結(jié)構(gòu)。取出2.5%戊二醛固定好的睪丸組織，用1%鋨酸固定液固定，丙酮梯度脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾－檸檬酸鉛雙重電子染色，JEM－1000型透射電鏡觀察并攝取圖像。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清LH、CORT、T水平的變化

與A組相比，B組大鼠血清T濃度顯著降低(P＜0.01)，CORT水平明顯升高的趨勢但未達到統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與B組相比，C組CORT濃度顯著降低(P＜0.05)，T水平稍微增加(P＞0.05);LH在3組中均無顯著變化。見表1。

表1 各組大鼠血清 LH、CORT、T水平的變化Tab.1 Comparison of the levels of serum LH，CORT and T among the 3 groups

2.2 各組大鼠睪丸HE染色改變

A組、B組和C組大鼠睪丸HE染色中均見曲細(xì)精管致密，基膜完好，支持細(xì)胞和各級生精細(xì)胞正常，間質(zhì)細(xì)胞胞漿豐富，嗜酸性。各組睪丸組織形態(tài)學(xué)未見明顯差異(圖1，見彩插 2)。

2.3 各組大鼠睪丸的電鏡改變

A組大鼠睪丸Leydig細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)清晰，基質(zhì)電子密度高，嵴呈管狀交錯排列，胞質(zhì)中見溶酶體，可見大小不等的圓形或卵圓形深染分泌顆粒。B組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞見線粒體腫脹，電子密度增高，嵴減少或消失。C組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞見線粒體結(jié)構(gòu)趨向于正常，可見200～400 nm左右大小不等深染的分泌顆粒(圖2)。

圖2 三組大鼠睪丸超微結(jié)構(gòu)的變化 (A:對照組;B:應(yīng)激組;C:五味子組)(為溶酶體，為線粒體)Fig.2 The ultrastructure of the testis cells in the rats of each group.A:Control group;B:Stress control group;C:Schisandra administration group.(lysosome， mitochondrion)

3 討論

應(yīng)激是指機體在各種內(nèi)外環(huán)境因素刺激下所出現(xiàn)的全身性非特異性反應(yīng)，但過度和失衡狀態(tài)的持續(xù)會引起軀體功能的紊亂和疾病的發(fā)生。愈來愈多的證據(jù)表明，在目前嚴(yán)重影響人類健康的疾病中，多數(shù)與應(yīng)激因素的長期作用密不可分。應(yīng)激的機制廣泛而復(fù)雜，主要是通過交感神經(jīng)－腎上腺髓質(zhì)軸和下丘腦－腺垂體－靶腺軸進行調(diào)節(jié)。其中下丘腦－垂體－性腺軸是參與應(yīng)激反應(yīng)的重要組成部分，也是容易受到應(yīng)激危害的系統(tǒng)。負(fù)性心理因素及高強度運動會造成機體的過度應(yīng)激，抑制下丘腦－垂體－睪丸軸(HPG)功能［2］，而 HPG軸功能下降是造成運動能力下降的重要因素。

本實驗發(fā)現(xiàn)實驗性水上漂浮及高強度運動大鼠與非應(yīng)激對照組相比，血清睪酮水平顯著下降。雖然HE染色未見睪丸形態(tài)明顯改變，但電鏡結(jié)果顯示睪丸Leydig細(xì)胞線粒體水腫，呈分泌功能減退的形態(tài)學(xué)改變。大量研究表明嚴(yán)重心理應(yīng)激如恐懼、精神壓力、情緒低落等引起的心理應(yīng)激均會使血睪酮水平顯著降低［3］。運動對睪酮水平的影響與運動的密度、負(fù)荷強度、負(fù)荷持續(xù)時間等因素有關(guān)［4－5］。長時間大強度運動會引起睪酮水平明顯降低。其可能機制主要有:外周組織尤其是肌肉組織對睪酮的消耗增加，睪丸自身調(diào)節(jié)功能變化和機體HPG軸受抑制。本研究中應(yīng)激大鼠睪酮水平下降，而LH水平未見明顯變化，可能的原因是大運動量訓(xùn)練可造成LH對GnRH的應(yīng)答能力受抑，使LH不能在低血清T時出現(xiàn)反饋性增加。低血清睪酮可能是由于訓(xùn)練導(dǎo)致大鼠在力竭運動時更完全動用睪酮儲備，也和應(yīng)激引起LH受體表達的變化有關(guān)［6］。有學(xué)者認(rèn)為應(yīng)激引起 HPG受抑制與應(yīng)激導(dǎo)致下丘腦－垂體－腎上腺(HPA)軸激活密切相關(guān)［7］。長時間劇烈運動后，由于下丘腦分泌CRH增加，并作用于腺垂體，引起腺垂體釋放ACTH，使腎上腺皮質(zhì)分泌腎上腺皮質(zhì)激素量增多，腎上腺皮質(zhì)激素持續(xù)增加抑制多種激素分泌，其中包括抑制性激素的合成，而且還誘導(dǎo)leydig細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致睪酮水平下降［8］。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激組大鼠CORT明顯高于非應(yīng)激對照組，提示高CORT是導(dǎo)致睪酮水平下降的重要原因。

許多實驗所證實力竭運動可引起氧化應(yīng)激，使機體產(chǎn)生的自由基增多，自由基的異常增多引起細(xì)胞及亞細(xì)胞器如線粒體損傷，造成細(xì)胞功能下降，進而影響運動能力。五味子具有收斂固澀，益氣生津，補腎寧心等功效，對自由基引起的損傷有明顯的保護作用。本課題組孫玲君等研究發(fā)現(xiàn)五味子可降低應(yīng)激大鼠CORT水平，并在一定程度上保護腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)［9］。本實驗中，灌服五味子大鼠CORT水平明顯低于應(yīng)激組(P＜0.05)，使之趨于正常，說明五味子有調(diào)節(jié) HPA功能，防治應(yīng)激損傷。與應(yīng)激組相比，五味子干預(yù)組僅能部分提高T的水平(P＞0.05)，但干預(yù)組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中見線粒體結(jié)構(gòu)趨向于正常，并可見較多大小不等的分泌顆粒，表明五味子可以保護應(yīng)激大鼠睪丸的超微結(jié)構(gòu)。這與五味子抑制增高的皮質(zhì)酮水平，從而減少對睪丸的影響密切相關(guān)。五味子如何改善睪丸超微結(jié)構(gòu)機制還不清楚。五味子含有多種活性成分，不同劑量有不同作用，這可能是本研究中五味子未能有效防止應(yīng)激造成的低睪酮血癥的原因，有待下一步通過不同劑量五味子進行實驗以明確。

綜上所述，五味子能保護顯著降低應(yīng)激大鼠CORT水平，保護應(yīng)激大鼠睪丸的超微結(jié)構(gòu)，提示五味子可在某一方面改善心理應(yīng)激和運動應(yīng)激所造成的內(nèi)分泌系統(tǒng)的紊亂，增強大鼠的抗應(yīng)激能力。

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Effects of Schisandra on the Function of the Pituitary-Gonadal Axis of Rats Undergoing Negative Psychological Stress Induced by Experimental Navigation and Intensive Exercise

LU Bin，WANG Jian，SUN Lin－jun，WANG Qun，LI Jie，WANG Yang－tian，HU Lan－ping
(Department of Endocrinology，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region，Nanjing 210002，China)

Objective To study the effects of schisandra on the function and ultrastructure of the pituitary－gonadal axis in rats undergoing experimental navigation and intensive exercise.Methods Thirty－four male SD rats were randomized into three groups:non－stress group(Group A)，stress control group(Group B)，and schisandra administration group(Group C).Blood samples were collected from the group A after a 7－day intragastric administration of saline.Group B

7－day intragastric administration of saline，underwent intensive exercise for 10 days.The rats of group C were subjected to the same process of running training as the B group and received intragastric administration of schisandra.Blood samples were obtained to determine the levels of testosterone(T)，corticosterone(CORT)，and luteinizing hormone(LH).The testes were excised for HE staining and electron microscopy.Results Compared with the group A，the level of testosterone was significantly decreased in the group B(P＜0.01).Compared with the group B，the CORT level was decreased(P＜0.05)and T level was not changed in the group C.For the level of LH，there were no significant differences among three groups(P＞0.05).HE staining revealed no significant difference in the histopathology of testisamong the three groups.Ultrastructural observation showed that the number of granules in the Leydig cells in the testes significantly increased in the group C compared with that in the group B，and the Leydig cells showed mitochondrial swelling，decreased/disappearance of the mitochondrial cristae and increased cell electron density in the group B，but somehow returning to normal appearance in the group C.Conclusion Schisandra can reduce the CORT level，but has little effect on T level.Schisandra may ameliorate the ultrastructural changes of testis in rats with stress.

Schisandra;Navigation;Intensive Exercise;Testosterone;Corticosterone;Rat

R332

A

1671－7856(2010)08－0026－04

2010－03－15

圖1 三組大鼠睪丸HE染色 （A：安靜組；B：應(yīng)激組；C：五味子組）
Fig.1 Histological appearance of the testes in the 3 groups， HE staining.

A: Control group; B: Stress control group; C: Schisandra administration group.

南京軍區(qū)“十一五”面上課題(06MA132)。

盧斌(1977－)，男，博士，研究方向:胰島素抵抗。

王堅，Email:jianwang_11@yahoo.com。