暢 怡，聶秀紅，曹若瑾，蔡彥寧，馮 明

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100053;2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院北京老年病研究所神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京 100053;3.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院綜合科，北京 100053)

增齡對(duì)大鼠膈肌Glut－1和Glut－4mRNA表達(dá)的影響

暢 怡1，聶秀紅1，曹若瑾3，蔡彥寧2，馮 明3

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100053;2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院北京老年病研究所神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京 100053;3.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院綜合科，北京 100053)

目的 研究大鼠膈肌Glut－1和Glut－4 mRNA的增齡變化情況，進(jìn)一步探討增齡對(duì)呼吸肌代謝及功能變化的機(jī)制。方法 雄性健康清潔級(jí) SD大鼠24月齡7只、3月齡12只，應(yīng)用RT－PCR方法檢測(cè)大鼠膈肌 Glut－1、Glut－4 mRNA表達(dá)。結(jié)果 老年組大鼠Glut－1、Glut－4 mRNA表達(dá)較年輕組表達(dá)明顯升高。結(jié)論 大鼠膈肌不同于單純骨骼肌和心肌，Glut－1、Glut－4 mRNA的表達(dá)具有特殊的增齡趨勢(shì)。

膈肌;葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;增齡;大鼠

隨著年齡的增長(zhǎng)，人的許多生理功能退化，最常見(jiàn)的有視力和聽(tīng)力的減退。然而關(guān)于骨骼肌，同樣存在增齡變化如肌肉萎縮，肌肉緊張度降低，選擇性的快肌纖維萎縮以及線粒體酶和糖酵解酶減少，這些改變往往可以引起摔倒，骨折和臥床，而這些問(wèn)題帶來(lái)很多社會(huì)問(wèn)題。抑制這些增齡變化對(duì)延緩衰老非常重要［1］。

膈肌是最重要的呼吸肌，隨著年齡增長(zhǎng)膈肌功能減退。在康復(fù)方面膈肌發(fā)揮非常重要的作用，包括外科手術(shù)前后的呼吸功能康復(fù)，慢性阻塞性肺疾病的家庭氧療和運(yùn)動(dòng)時(shí)心肺反應(yīng)。在治療急性或慢性呼吸系統(tǒng)疾病時(shí)許多康復(fù)治療師把腹式呼吸(膈式呼吸)作為呼吸肌肉鍛煉的首選。研究膈肌功能和形態(tài)的增齡變化特點(diǎn)對(duì)查明骨骼肌的可塑性尤為重要。換句話說(shuō)，如果可以維持膈肌的功能，則可能抑制肌肉的增齡變化，降低老年人呼吸功能障礙的發(fā)生率。已有研究表明由于肌漿網(wǎng)鈣離子－ATP酶活性和肌球蛋白重鏈組成改變導(dǎo)致老年膈肌的收縮和舒張速度減慢［1］。但目前尚無(wú)從葡萄糖代謝方面研究膈肌的增齡變化。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)是糖原合成及糖酵解的限速步驟，而葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)依靠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter，Glut)的介導(dǎo)發(fā)揮作用。Glut－1 及 Glut－4是膈肌主要的Gluts。Glut－1、Glut－4 mRNA 表達(dá)的年齡變化趨勢(shì)受種屬、組織類型、運(yùn)動(dòng)水平及干預(yù)方式等因素的影響［3－15］。因此，本文通過(guò)觀察不同年齡組大鼠膈肌細(xì)胞內(nèi) Glut、Glut－4 mRNA表達(dá)變化，探討增齡對(duì)膈肌細(xì)胞利用葡萄糖的影響，同時(shí)進(jìn)一步探討增齡對(duì)呼吸肌代謝及功能變化的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

雄性健康SPF級(jí)SD大鼠 (北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，許可證編號(hào) SCXK(京)2002－0001)，24月齡，7只;3月齡，12只，應(yīng)用10%水合氯醛以300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，大鼠麻醉成功后，將其仰臥于平臺(tái)上，伸展固定四肢。開(kāi)胸腹充分暴露內(nèi)臟，迅速分離完整膈肌，并立即放于液氮中速凍，后轉(zhuǎn)移于－80℃冰箱中保存。

1.2 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

取1 μg總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;根據(jù)基因庫(kù)中的基因序列，合成PCR引物(表1);引物擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物于含有0.1 mg/L溴化乙啶的2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)在紫外線下攝取電泳圖譜并應(yīng)用核酸定量分析軟件 Quantity One(Bio－RAD)進(jìn)行分析(圖1);以看家基因β－actin的表達(dá)為內(nèi)對(duì)照，用擴(kuò)增基因/β－actin的灰度比值對(duì)該基因的表達(dá)進(jìn)行半定量。

圖1 β－actin 、Glut－1 和 Glut－4 mRNA 電泳示意圖Fig.1 Gel electrophoresis map of RT－PCR products of β－actin，Glut－1 and Glut－4 mRNA

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 11.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)采取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，以 P＜0.05有顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠膈肌 Glut-1/β-actin 和 Glut-4/β-actin mRNA增齡變化

24月齡大鼠(aged rats)較3月齡大鼠(young rats)的 Glut－1/β－actin、Glut－4/β－actin mRNA 升高，差異有顯著性意義(P＜0.01)(圖2)。

圖2 不同月齡大鼠膈肌 Glut－1和 Glut－4 mRNA表達(dá)Fig.2 Compared with young rats，the mRNA contents of Glut－1 and Glut－4 in diaphragm are higher in the aged rats

3 討論

膈肌是膈式呼吸最主要的呼吸肌，并且是生命依賴的骨骼肌，因此與其他四肢骨骼肌比較，膈肌更為重要。隨著年齡增長(zhǎng)膈肌功能也減退，尤其在病理情況下老年人更易出現(xiàn)呼吸功能的障礙。因此研究老年膈肌的功能減退的生理機(jī)制，可以為老年呼吸功能障礙提供治療基礎(chǔ)。膈肌具有終身節(jié)律收縮的特點(diǎn)。肌肉收縮的能量來(lái)源于葡萄糖的供給，而葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)是糖原合成及糖酵解的限速步驟。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)則依靠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter，Glut)的介導(dǎo)發(fā)揮作用。

表1 引物序列Tab.1 List of primers used for RT－PCR

Glut－1、Glut－4 mRNA 表達(dá)的年齡變化趨勢(shì)受種屬、組織類型、運(yùn)動(dòng)水平及干預(yù)方式等因素的影響［3－16］。Louis等人的研究結(jié)果表明小鼠的心肌及骨骼肌Glut－1和Glut－4 mRNA的表達(dá)隨年齡的增加而增加，但成年小鼠與老年小鼠 Glut－1和 Glut－4 mRNA表達(dá)差異無(wú)顯著性［13］。大鼠骨骼肌和心肌Glut－1 和 Glut－4 mRNA 表達(dá)隨年齡增長(zhǎng)而下降，心肌的 Glut－1 和 Glut－4 mRNA表達(dá)明顯高于骨骼肌［10］。本文研究結(jié)果顯示24月齡大鼠膈肌 Glut－1和Glut－4mRNA表達(dá)較3月齡大鼠明顯增高，與上述研究結(jié)果不一致，其可能原因膈肌雖屬于骨骼肌，但它像心肌一樣終生反復(fù)節(jié)律性地收縮。由于膈肌本身的特性，決定 Glut－1、Glut－4 mRNA 增齡表達(dá)趨勢(shì)不同于單純骨骼肌和心肌。有研究表明隨著增齡膈肌的糖酵解酶與有氧氧化酶的比值減小，說(shuō)明老年膈肌的糖酵解能力減弱，而有氧活動(dòng)增加［2］，無(wú)論是糖酵解還有氧活動(dòng)的能量都來(lái)源于葡萄糖，而此時(shí)膈肌的 Glut－1、Glut－4 mRNA 表達(dá)升高可以增加膈肌葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而保持膈肌持續(xù)地收縮活動(dòng)，最終達(dá)到滿足維持生命所需的的通氣和換氣功能。

總之，大鼠膈肌不同于單純骨骼肌和心肌，Glut－1、Glut－4 mRNA 的表達(dá)具有特殊的增齡趨勢(shì)。

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Age-Related Changes of Glut-1 and Glut-4 mRNA Expression in the Rat Diaphragm

CHANG Yi1，NIE Xiu－h(huán)ong1﹡，CAO Ruo－jin3，CAI Yan－ning2，F(xiàn)ENG Ming3
(1.Department of Respiratory Medicine;2.Department of Molecular Neurology，Beijing Institute of Geriatrics;3.Department of Integrative Medicine，Beijing Xuanwu Hospital，Capital University
of Medical Sciences，Beijing 100053，China)

Objective The aim of this study was to investigate the age－related changes in Glut－1 and Glut－4 mRNA expression in the rat diaphragmatic muscle.Methods The expressions of Glut－1 and Glut－4 mRNA in the diaphragmatic muscle of SD rats(24 months old，n=7;3 months old，n=12)were analyzed by RT－PCR.Results In the aged groups，the expression of Glut－1 and Glut－4 mRNA in the diaphragmatic muscle was markedly higher than that in young groups.Conclusions There is a characteristic age－related tendency of Glut－1 and Glut－4 mRNA expression in the diaphragmatic muscle，different from that in the skelet al and cardiac muscles.

Diaphragm;Glucose transporter;Aging;Rat

R－33

A

1671－7856(2010)08－0015－03

2010－04－08

暢怡(1979－)，女，碩士。

聶秀紅(1963－)，女，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向:肺老化機(jī)制研究，電話:010－83198668，E－mail:xwyyhxk@126.com。