黃吉峰，金祈卓，劉麗燕，王名蓂，李顯筑 (指導(dǎo))

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江省中西醫(yī)結(jié)合研究所，黑龍江 哈爾濱 150090)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病代謝異常引起的腎小球硬化造成腎功能損害和障礙，是糖尿病最常見而又最難治的微血管并發(fā)癥，可增加心血管事件的發(fā)生率與死亡率，是糖尿病患者致殘與死亡的重要因素之一［1］。近年來的研究表明，細(xì)胞凋亡與DN發(fā)生密切相關(guān)，為進(jìn)一步揭示DN的發(fā)病機(jī)理及中藥腎白寧的作用機(jī)制，我們開展了腎白寧對(duì)DN細(xì)胞凋亡影響的研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物 腎白寧:由哈爾濱世一堂研究所配制成浸膏(藥物組成:黃芪50g，熟地黃20g，山藥15g，山茱萸15g，牡丹皮 15g，茯苓 25g，澤瀉 15g，桑螵蛸 35g，水蛭10g，白花蛇舌草45g，當(dāng)歸15g，益母草15g等);洛汀新 (貝那普利，北京諾華制藥有限公司，批號(hào):X1266)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康SD雄性大鼠(200～240g)60只。

1.2.2 糖尿病腎病模型的建立 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)取15只為假手術(shù)組，假手術(shù)組大鼠在腹腔麻醉狀態(tài)下，背部切口，剝離左腎脂肪包膜，關(guān)閉縫合切口。其余大鼠腹腔麻醉下進(jìn)行左側(cè)腎臟切除術(shù)，術(shù)后恢復(fù)2w。將STZ溶于0.1mol·L－1檸檬酸緩沖液(pH4.4)中，避光條件下迅速配成濃度為1%STZ溶液。動(dòng)物禁食12h后，按照50mg·kg－1劑量，予以STZ腹腔注射;72h后，尾靜脈取血，測(cè)定空腹血糖，空腹血糖≥16.7mmol·L－1作為 DN大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 分組與給藥 造模成功后大鼠隨機(jī)分為模型組、中藥組、對(duì)照組及假手術(shù)組各15只，共60只。各組自造模成功第1d起開始給藥。假手術(shù)組，模型組:給予每日1次1mL蒸餾水灌胃;中藥組:將腎白寧浸膏溶于生理鹽水，配制成混懸液，以2.97g·kg－1灌胃，每日1次;對(duì)照組:洛汀新(貝那普利)溶于生理鹽水，配制成混懸液，0.9mg·kg－1灌胃，每日1次。均給藥12w，每2w稱重調(diào)整劑量。給藥期間每組大鼠分籠飼養(yǎng)，隨意飲水，食用標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料。

1.2.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

采用原位末端標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Bax，Bcl－2檢測(cè)采用免疫組化的方法，并使用圖像采集系統(tǒng)測(cè)定陽性反應(yīng)面積，每張切片隨機(jī)選取五個(gè)視野，每組分析15個(gè)標(biāo)本。此項(xiàng)內(nèi)容由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科幫助完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

12w后光鏡下可見模型組腎小球毛細(xì)血管球萎縮，球囊腔略增大，腎小球出入球小動(dòng)脈有輕度內(nèi)皮細(xì)胞增生及纖維化，基底膜略增厚，遠(yuǎn)曲小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)充血，水腫，血細(xì)胞浸潤，并有輕度間質(zhì)纖維化。模型組，中藥組，對(duì)照組細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)較假手術(shù)組高，有顯著性差異(P<0.01);中藥組，對(duì)照組與模型組比較陽性表達(dá)低(P<0.01);中藥組與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)。腎小球中Bax，Bcl－2表達(dá)各組幾乎為陰性，腎小管中Bax，Bcl－2表達(dá)假手術(shù)組顯著低于其他三組(P<0.01);中藥組，對(duì)照組與模型組比較Bax陽性表達(dá)低(P<0.01)，而Bcl－2表達(dá)高(P<0.01);中藥組與對(duì)照組比較無明顯差異(P>0.05)，結(jié)果見表1。

表1 各組腎組織細(xì)胞凋亡及Bax，Bcl－2表達(dá)情況(±s)

表1 各組腎組織細(xì)胞凋亡及Bax，Bcl－2表達(dá)情況(±s)

注:與假手術(shù)組比較，*P<0.01，與模型組比較，△P<0.01。

組別 n 細(xì)胞凋亡Bax Bcl－2假手術(shù)組15 8.69±0.56 10.03±0.74 8.98±1.85模型組 15 42.48±0.61* 39.38±3.07* 23.03±0.85*中藥組 15 24.17±0.81*△ 26.42±0.71*△ 37.16±1.92*△對(duì)照組 15 25.52±0.64*△ 26.17±0.92*△ 35.95±0.97*△

3 討論

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程，最后細(xì)胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，被其他細(xì)胞吞噬［2］。

細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的一種主動(dòng)連續(xù)的程序化反應(yīng)，Bcl－2蛋白的生理功能主要是抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞壽命，而不影響細(xì)胞周期和分化［3，4］。Bax是拮抗Bcl－2的促凋亡因子，它是Bcl－2結(jié)合蛋白，并與其有同源序列。Bcl－2的過剩有助于細(xì)胞存活，而Bax 的過剩有助于細(xì)胞死亡［3，4］。

Ortiz等［5］研究發(fā)現(xiàn)，高糖濃度促進(jìn)了凋亡調(diào)節(jié)基因Bcl－2的表達(dá)下調(diào)及Bax基因表達(dá)的上調(diào)，促進(jìn)近端小管上皮細(xì)胞凋亡。同時(shí)體內(nèi)研究表明，在糖尿病db/db鼠腎皮質(zhì)Bcl－2基因表達(dá)下降，Bax基因表達(dá)上調(diào)，與非糖尿病db/m鼠比較，前者變化與凋亡指數(shù)相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中藥組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯少于模型組，與對(duì)照組無顯著性差異。腎白寧通過抑制Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl－2表達(dá)而起到了抑制腎組織細(xì)胞凋亡的作用，保護(hù)了腎功能，延緩了DN的進(jìn)展。

［1］ 馬艷春，周波，張立凈，等.中藥治療糖尿病腎病的作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2009，37(6):105 －108.

［2］ 溫進(jìn)坤，韓梅.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)理論與研究技術(shù)［M］.第2版.北京:科學(xué)出版社，2002:244－261.

［3］ White E.Life，death，and the pursuit of apoptosis［J］.GenesDev，1996，10(1):1 －15.

［4］ 趙燕，楊秋萍.糖尿病腎病與細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2007，13(12):911 －913.

［5］ Ortriz A，Ziyadeh FN，Neilson EG.Expression of apoptosis－regulatory gene in renal proximal tubular epithelial cellsexposed to high ambient glucose and in diabetic kidneys［J］.Invest Med，1997，45(2):50 －56.