劉相輝，裴福成，任桂萍，楊柳

(1.哈爾濱市食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江 哈爾濱 150028;2.哈藥集團中藥二廠，黑龍江 哈爾濱 150078;3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150030;4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

水蛭為水蛭科動物螞蟥 (Whitmania pigra Whitman)、水蛭(Hirudo nipponica Whitman)或柳葉螞蟥(Whitmania acranulata Whitman)的干燥全體。具有破血，逐瘀，通經(jīng)之功效［1］。主含蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸類［2］。前期試驗中，我們曾采用柱前衍生法測定了地龍中的氨基酸含量［3］，收到了較好的效果。本實驗采用同樣的測定方法進行了水蛭提取物中游離氨基酸和水解總氨基酸的含量測定研究，為水蛭的質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

Agilent 1100系列高效液相色譜儀:1311A四元梯度泵，1313A自動進樣器，1315A二極管陣列檢測器(DAD)。

17種混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、硼酸鹽緩沖液、鄰苯二甲醛(OPA)試劑及9－芴甲基氯甲酸酯(FMOC)均由Agilent公司提供;甲醇、乙腈(色譜純)，其他試劑均為分析純，超純水。

水蛭(螞蟥)藥材購于安國藥材公司。

2 液相色譜條件

色譜柱:AgilentZOBAX Eclipse－AAA柱(4.6mm ×150mm，3.5μm)，流動相 A:40mM NaHPO4 pH 7.8;B:乙腈 －甲醇 －水=45:45:10(V/V/V)，流速2mL·min－1。梯度程序見表1。

檢測器設(shè)置:檢測波長:338nm，帶寬10nm;參比波長:390nm，帶寬20nm;14.6min后檢測波長:262nm，帶寬16nm;參比波長:324nm，帶寬8nm;柱溫:40℃。

進樣:樣品與衍生劑(OPA和FMOC)用自動程序反應(yīng)后進樣。

表1 梯度洗脫程序表

圖1 氨基酸分析HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of amino acids

3 實驗方法與結(jié)果

3.1 水蛭提取物的制備

稱取水蛭粗粉5g，加水30mL，浸泡60min，超聲處理(250W，50Hz)60min，離心(12000 r·min－1)10min，取上清液，備用。

3.1.1 完全酸水解氨基酸樣品制備

精密量取水蛭提取物溶液1.5mL，加6 mol·L－1鹽酸10mL，抽真空脫氣，N2密封保護，在110℃下水解24h，冷卻后打開水解管，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，水浴揮干鹽酸，再用水洗數(shù)次，徹底揮干鹽酸，用0.1mol·L－1鹽酸溶解，并定容至 10mL，0.45μm 濾膜濾過，濾液備用。

3.1.2 游離氨基酸樣品制備

精密量取水蛭提取物溶液3.0mL，加入乙腈9.0mL，搖勻，0.45μm濾膜濾過，殘渣加適量乙腈溶液(乙腈－水=3∶1，v/v)洗滌，濾膜濾過，合并濾液，減壓揮干溶劑，用 0.1mol·L－1鹽酸溶解，并定容至10mL，0.45μm濾膜濾過，濾液備用。

3.2 工作曲線的繪制

將17種混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為1nmol·μL－1) 用 0.1mol·L－1鹽酸依次稀釋成 0.750、0.500、0.250、0.100nmol·μL－1，進行衍生和分析。結(jié)果，在試驗濃度范圍內(nèi)，除脯氨酸線性關(guān)系相對較差外(r=0.996)，其余16種氨基酸的線性相關(guān)系數(shù)均在0.999以上(n=5)。

3.3 精密度試驗

用混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進樣5次，結(jié)果17種氨基酸的出峰時間及峰面積RSD均在0.9%以內(nèi)。

3.4 重復(fù)性試驗

制備完全酸水解氨基酸樣品和游離氨基酸樣品各6份，分別進行氨基酸含量測定，結(jié)果酸水解總氨基酸(mg·g－1)分別為 29.04，29.71，29.13，30.29，29.96，30.09，平均為29.70，其 RSD值為1.74%;游離總氨基酸(mg·g－1) 結(jié)果分別為 10.69，11.08，10.85，11.03，11.26，11.17，平均為 11.01，其 RSD 值為1.91%。

3.5 回收率試驗

采用混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入法進行試驗，結(jié)果完全酸水解總氨基酸平均回收率為98.3%，RSD為2.07%;游離總氨基酸平均回收率為97.7%，RSD為2.14%。

4 討論

4.1 用水解總氨基酸含量減去游離氨基酸含量可間接得到水蛭提取物中抗凝溶栓活性蛋白及多肽類成分的含量。

4.2 在游離氨基酸測定過程中，為避免大分子蛋白類物質(zhì)對色譜柱產(chǎn)生污染，除采用常規(guī)的保護色譜柱外，我們采用乙腈沉淀法對提取液進行預(yù)處理。試驗結(jié)果證實，樣品溶液與乙腈比例為1∶3(v/v)時，處理效果最佳。

4.3 水蛭提取液中各種氨基酸的含量差別很大。因此，用等摩爾濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液所作的校正曲線，其線性范圍不能涵蓋所有的氨基酸，建議最好根據(jù)實際樣品中各氨基酸的具體含量情況配制不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液來作校正曲線。

4.4 在試驗條件下，游離氨基酸樣品和水解總氨基酸樣品中均沒有檢測出CY2(胱氨酸)，但均檢測到HYP(羥脯氨酸)，由于沒有供含量測定用對照品，因此未對其含量進行測定。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［2］ 黃榮清，孫曉東，李艷玲，等.水蛭的研究進展［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報，2004，2(5):387 －389.

［3］ 裴福成，李長新，任桂萍.柱前衍生HPLC法測定地龍中氨基酸的含量［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2007，35(3):26 －27.