鞠興榮，金 晶，袁 建，王立峰,2，何 榮,2

液態(tài)發(fā)酵法制備菜籽ACE抑制肽菌種的篩選

鞠興榮1，金 晶1，袁 建1，王立峰1,2，何 榮1,2

(1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210003；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

采用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉、白地霉、產(chǎn)朊假絲酵母、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉對(duì)菜籽粕進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，以氮溶解指數(shù)、SN-TCA、氨基酸態(tài)氮、肽得率和ACE抑制活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽ACE抑制肽的菌種進(jìn)行篩選。結(jié)果表明：在上述菌種中枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵所得肽得率最高，并且具有最高的ACE抑制活性，菌種優(yōu)勢(shì)明顯，是液態(tài)發(fā)酵菜籽粕生產(chǎn)ACE抑制肽的優(yōu)勢(shì)菌種。

菜籽肽；液態(tài)發(fā)酵；菌種篩選；ACE抑制肽

菜籽餅粕是菜籽榨油之后的副產(chǎn)品，其蛋白含量為35%～42%[1]。菜籽蛋白經(jīng)水解產(chǎn)生的小肽具有多種生物活性，其中ACE抑制肽由于安全性高、副作用少、易吸收，已經(jīng)成為活性肽研究的熱點(diǎn)[2-3]。發(fā)酵法制備大豆[4-6]和牛奶[7-8]的ACE抑制肽的研究在我國已有報(bào)道，而使用液態(tài)發(fā)酵制備菜籽ACE抑制肽的研究目前在國內(nèi)還屬于空白，因此具有很高的研究?jī)r(jià)值。

菌種的選擇對(duì)菜籽ACE抑制肽的制備非常關(guān)鍵，這主要是因?yàn)橐簯B(tài)發(fā)酵條件下不同的菌種所產(chǎn)的蛋白酶不同，其對(duì)菜籽蛋白的作用位點(diǎn)也不相同，導(dǎo)致其水解產(chǎn)物的生物活性差別很大[9]。本實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉、白地霉、產(chǎn)朊假絲酵母、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉對(duì)菜籽粕進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，以ACE抑制活性為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，并考察氮溶解指數(shù)、SN-TCA、氨基酸態(tài)氮、肽得率，對(duì)液態(tài)發(fā)酵制備ACE抑制肽的菌種進(jìn)行比較研究，篩選出液態(tài)發(fā)酵法制備ACE抑制肽的優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與菌種

菜籽粕，以Canola菜籽為原料，通過索氏抽提脫油制得，粗蛋白含量43.26%；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE，酶活力0.25U)、HHL、Gly-Gly-Tyr-Arg Sigma公司。

三氯乙酸(TCA)、甲醛等其他試劑均為分析純。

Bacillus.subtilis 10160、Candida utilis 1769、Aspergillus niger 2377、Bacillus licheniformis 20006、Geotrichum candidum 31418、Candida utilis 40294、Actinomucor elegans 40252 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 儀器與設(shè)備

立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司；PHS-3C型精密數(shù)顯pH計(jì)、722N紫外-可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器廠；GL-20B型高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；全溫立式振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 斜面培養(yǎng)

將保藏菌種接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基(按各菌種說明書配制)，在一定溫度(霉菌28℃，細(xì)菌30℃)、一定時(shí)間(細(xì)菌24h，霉菌5d)下進(jìn)行培養(yǎng)，使其轉(zhuǎn)接活化。

1.3.2 菌種活化

挑取兩環(huán)種子培養(yǎng)基活化后菌株，接入錐形瓶，8層紗布封口，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，控制溫度30℃，轉(zhuǎn)速180r/min，細(xì)菌培養(yǎng)24h，霉菌培養(yǎng)3d。使其菌體濃度達(dá)到108個(gè)/mL。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

從已制備好的種子培養(yǎng)基中取出一定體積的菌懸液接入已滅菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的料液比1:20(m/V)，接種量為1:20(V/V)，8層紗布封口，控制在30℃，180r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時(shí)間后取樣進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 發(fā)酵液處理

將培養(yǎng)一定時(shí)間的發(fā)酵產(chǎn)物取出，2～4℃、4000×g離心15min，測(cè)定其上清液體積，用0.45μm微孔濾膜過濾上清液，除去不溶物和細(xì)菌，備用。

1.3.5 氮溶解指數(shù)測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10]所述方法進(jìn)行測(cè)定。氮溶解指數(shù)按式(1)計(jì)算。

1.3.6 SN-TCA指數(shù)測(cè)定

參照文獻(xiàn)[11]所述方法，取5mL處理液，加入等體積質(zhì)量濃度為10g/100mL的三氯乙酸(TCA)，靜置30min，2～4℃、5000×g離心20min，取5mL上清液進(jìn)行微量凱式定氮，測(cè)定其氮含量。SN-TCA指數(shù)按式(2)計(jì)算。

1.3.7 氨基酸態(tài)氮得率測(cè)定

采用甲醛滴定法[12]測(cè)定提取液中－NH2含量，氨基酸態(tài)氮按式(3)計(jì)算。

1.3.8 肽得率測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13]所述方法，取2.5mL處理液，加入等體積10g/100mL的三氯乙酸(TCA)，靜置30min，2～4℃、5000×g離心20min，取2mL上清液，加8mL雙縮脲試劑，25℃靜置30min，測(cè)OD540nm值。肽得率按式(4)計(jì)算。

1.3.9 ACE抑制活性測(cè)定

參照Cushman等[14]的方法，作出適當(dāng)?shù)男薷?，具體步驟如下：用含有0.3mol/L NaCl的0.1mol/L硼酸鹽緩沖液(pH8.3)將HHL配制成5.0mmol/L的溶液。取100μL的HHL和40μL的水解產(chǎn)物混合，于37℃保溫3min后，加入10μL ACE(溶于蒸餾水，活力為0.1U/mL)，混勻后37℃保溫30min，再加入250μL的1mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，再加入1.7mL醋酸乙酯，15s振蕩混勻，5000×g離心10min，用移液管吸取1mol/L醋酸乙酯層，真空冷凍干燥2h后，加入3mL蒸餾水，在228nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。ACE抑制活性按式(5)計(jì)算。

式中：A為ACE及ACE抑制肽均參與時(shí)所測(cè)的吸光度；B為ACE抑制肽不參與時(shí)所測(cè)的吸光度；C為ACE不參與時(shí)所測(cè)的吸光度。

2 結(jié)果與分析

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，在24～48h內(nèi)，液態(tài)發(fā)酵菜籽蛋白的效果較好，所得各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到最優(yōu)值，因此，選用在24、36、48h的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來進(jìn)行分析。

2.1 不同菌種液態(tài)發(fā)酵對(duì)菜籽蛋白氮溶解指數(shù)的影響

氮溶解指數(shù)反映發(fā)酵水解液中可溶性氮的含量，從一定程度上也可以反映發(fā)酵效果的好壞。由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，各個(gè)菌種的氮溶解指數(shù)都有所增加，這是由于隨著發(fā)酵的進(jìn)行，菌種代謝所產(chǎn)生的蛋白酶將菜籽蛋白逐步水解，產(chǎn)生了易溶于水的小分子短肽和氨基酸。通過比較可以得出：黑曲霉、白地霉、產(chǎn)朊假絲酵母的氮溶解指數(shù)在經(jīng)過一定時(shí)間的液態(tài)發(fā)酵后，與原樣相比并沒有顯著提高，原因可能是液態(tài)發(fā)酵的環(huán)境不適合這幾種菌種的產(chǎn)酶或菜籽粕中存在不適合這幾種菌產(chǎn)蛋白酶的因子；宇佐美曲霉和雅致放射毛霉的氮溶解指數(shù)居中，在50%左右；枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的發(fā)酵效果最好，其氮溶解指數(shù)均超過50%，其中枯草芽孢桿菌在發(fā)酵48h的條件下氮溶解指數(shù)高達(dá)69.4%，說明發(fā)酵過程中產(chǎn)生了較多的蛋白酶，使蛋白質(zhì)大量水解。

圖1 不同菌種液態(tài)發(fā)酵對(duì)氮溶解指數(shù)的影響Fig.1 Comparison of NSI using different fermentation strains

2.2 不同菌種發(fā)酵菜籽蛋白對(duì)菜籽蛋白SN-TCA指數(shù)的影響

SN-TCA指數(shù)是在特定條件下，經(jīng)過三氯乙酸沉淀后水解產(chǎn)物中可溶性氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。三氯乙酸作為一種蛋白質(zhì)沉淀劑，可以沉淀蛋白質(zhì)和大分子的肽段，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，蛋白質(zhì)肽鏈被切成大小不等的肽段，SN-TCA指數(shù)會(huì)隨之提高，SN-TCA指數(shù)可以定性地反應(yīng)蛋白質(zhì)的分解情況，溶解指數(shù)越高，表明較短肽段的含量越高。

圖2 不同菌種液態(tài)發(fā)酵對(duì)SN-TCA指數(shù)的影響Fig.2 Comparison of SN-TCA index using different fermentation strains

由圖2可知，SN-TCA指數(shù)與氮溶指數(shù)變化趨勢(shì)基本相似，黑曲霉、白地霉、產(chǎn)朊假絲酵母的SN-TCA指數(shù)同樣提高不明顯，而其他幾種菌種中，也僅有雅致放射毛霉的SN-TCA指數(shù)與氮溶解指數(shù)變化趨勢(shì)相比稍有提高，這可能是由于雅致放射毛霉發(fā)酵過程中，形成的可溶性蛋白較少，多為小分子短肽和氨基酸，SN-TCA指數(shù)表明枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、雅致放射毛霉在液態(tài)發(fā)酵條件下，短肽和氨基酸的含量較高。

2.3 不同菌種發(fā)酵對(duì)菜籽蛋白氨基酸態(tài)氮得率的影響

圖3 不同菌種液態(tài)發(fā)酵對(duì)氨基酸態(tài)氮得率的影響Fig.3 Comparison of amino nitrogen yield using different fermentation strains

由圖3可知，氨基酸態(tài)氮得率與氮溶解指數(shù)和SNTCA指數(shù)變化趨勢(shì)基本相似，也是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步增加，這說明各個(gè)菌種所產(chǎn)生的蛋白酶在水解蛋白的同時(shí)也產(chǎn)生了大量的端肽酶，將短肽水解成氨基酸。盡管黑曲霉的氮溶解指數(shù)不高，但是其氨基酸態(tài)氮得率卻很高，在48h達(dá)到了2.71%，這說明黑曲霉在液態(tài)發(fā)酵的條件下，產(chǎn)生的大多是端肽酶，因此，在水解過程中產(chǎn)生較多的氨基酸。

2.4 不同菌種發(fā)酵對(duì)菜籽蛋白肽得率的影響

圖4 不同菌種液態(tài)發(fā)酵對(duì)肽得率指數(shù)的影響Fig.4 Comparison of peptide yield using different fermentation strains

肽得率是發(fā)酵處理液中短肽含量與原料總量的比值，它反映了發(fā)酵產(chǎn)品中低分子短肽含量的高低，由圖4可知，24h是各個(gè)菌種肽得率最高的發(fā)酵時(shí)間，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各個(gè)菌種的肽得率均有所降低，這可能是由于到了發(fā)酵的后期，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各個(gè)菌種開始產(chǎn)生大量的外肽酶，將此前所產(chǎn)生的菜籽多肽進(jìn)一步水解成游離氨基酸，導(dǎo)致多肽含量的降低，由于外肽酶產(chǎn)生的量不同，因此肽得率減少的幅度也有所不同。通過比較可以發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵所得肽得率最高，可以達(dá)到22%左右，宇佐美曲霉次之，而其他菌種發(fā)酵的肽得率均不高。因此，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌比較適合進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵來生產(chǎn)低分子小肽。

2.5 不同菌種發(fā)酵對(duì)菜籽蛋白ACE抑制活性的比較

圖5 不同菌種液態(tài)發(fā)酵對(duì)ACE抑制活性的影響Fig.5 Comparison of ACE inhibition activity using different fermentation strains

ACE抑制肽也是一種ACE抑制劑，它通過對(duì)ACE的抑制而起到降血壓作用。ACE抑制活性對(duì)于篩選生產(chǎn)ACE抑制肽的菌種來說是一個(gè)很重要的指標(biāo)。由圖5可知，大部分菌種的ACE抑制活性在24h達(dá)到最大值，隨后逐步降低，這是由于對(duì)ACE起抑制作用的是一些特定序列的短肽，而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，短肽被進(jìn)一步水解，使其不再具有ACE抑制活性。與其他菌株相比，枯草芽孢桿菌的ACE抑制活性明顯較高，在發(fā)酵24h時(shí)可以達(dá)到70.5%，次之是地衣芽孢桿菌和雅致放射毛霉，發(fā)酵得到的小肽的ACE抑制活性也均超過50%以上，相比其肽得率，宇佐美曲霉盡管肽得率也不低，但發(fā)酵所得的小肽ACE抑制活性不高，這可能是由于其所產(chǎn)的蛋白酶作用位點(diǎn)不同，沒有得到具有ACE抑制作用的小肽。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過使用枯草芽孢桿菌等7種菌種進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，以ACE抑制活性為主要指標(biāo)，肽得率等為輔助指標(biāo)，旨在篩選出適合液態(tài)發(fā)酵環(huán)境，發(fā)酵產(chǎn)物中含有較高ACE抑制活性的小肽的菌種。

實(shí)驗(yàn)表明，枯草芽孢桿菌對(duì)菜籽粕進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，可以得到ACE抑制活性較高的小分子短肽，其最高ACE抑制活性超過70%，同時(shí)，通過液態(tài)發(fā)酵得到的肽得率可以達(dá)到25%左右，肽得率較高?？莶菅挎邨U菌在液態(tài)發(fā)酵條件下，各個(gè)指標(biāo)的優(yōu)勢(shì)都很明顯，因此，可以作為液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)高ACE抑制活性短肽的最佳菌種，用于今后的研究。實(shí)驗(yàn)還表明，黑曲霉在液態(tài)發(fā)酵條件下產(chǎn)生了大量的端肽酶，因此，若與其他菌株進(jìn)行聯(lián)用，可以起到脫苦等作用，適合用于混菌發(fā)酵。

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Screening of an Optimal Strain for Producing Rapeseed-originated Angiotensin I-converting Enzyme Inhibitory Peptides by Liquid-state Fermentation

JU Xing-rong1，JIN Jing1，YUAN Jian1，WANG Li-feng1,2，HE Rong1,2
(1. College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Key Laboratory of Grain and Oils Quality Control and Deep-Utilizing Technology of Jiangsu Province, Nanjing 210003, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to search for an optimal stain for the production of angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from rapeseed meal by liquid-state fermentation, seven common microorganisms including Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Aspergillus niger, Geotrichum candidum, Candida utilis, Actinomucor elegans and Aspergillus oryzae as a starter for rapeseed meal fermentation were compared for their differences in five fermentation parameters, namely peptide yield, nitrogen solubility index (NSI), amino nitrogen yield, soluble nitrogen in aqueous trichloroacetic acid (SN-TCA) content and ACE inhibition activity. Among the above microorganisms, Bacillus subtilis was found to give both the highest peptide yield and ACE inhibition activity and grow dominantly, thereby being a superior strain for the production of ACE inhibitory peptides from rapeseed meal by liquid-state fermentation.

rapeseed-derived peptide；liquid-state fermentation；strain screening；ACE inhibitory peptide

Q93.331

A

1002-6630(2010)19-0212-04

2010-01-10

國家農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2009C10045)；國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z331)；江蘇省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(08KJB55004)

鞠興榮(1957—)，男，教授，博士，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)及功能性成分研究與開發(fā)。E-mail：xingrongju@163.com