高志玲，陳 艷，謝英輝

黃花蒿揮發(fā)油的體外抑菌活性研究

高志玲，陳 艷，謝英輝

(白城醫(yī)學高等?？茖W校，吉林 白城 137000)

采用水蒸氣蒸餾法提取黃花蒿揮發(fā)油，通過體外抑菌實驗，利用紙片法和試管法分別測定其抑菌活性和最低抑菌濃度(MIC)。比較黃花蒿揮發(fā)油對12種常見細菌和真菌的抑菌活性。結(jié)果表明：黃花蒿揮發(fā)油對12種實驗菌表現(xiàn)出不同的抑制活性。真菌對黃花蒿揮發(fā)油具有更強的敏感性。黃花蒿揮發(fā)油對真菌的抑制作用比較穩(wěn)定，由強到弱依次為黑曲霉、啤酒酵母菌、產(chǎn)黃青霉、馬青霉、毛霉、青霉和根霉。

黃花蒿；揮發(fā)油；真菌；細菌；最低抑菌濃度

黃花蒿(Artemisia annua L.)菊科蒿屬(Artemisia)，為一年生草本植物，在全國各省份均有分布，是一種傳統(tǒng)中草藥，其地上部分常稱為青蒿。據(jù)我國藥典上記載，青蒿性苦、辛、寒；歸肝、膽經(jīng)。具有清熱解暑，除蒸，截瘧的功效[1]。黃花蒿的主要有效成分為青蒿素和揮發(fā)油等?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃花蒿具有抗瘧[2-3]、抗病毒[4]、殺螨蟲[5]、解熱抗炎[6]、抗氧化[7]和提高免疫力等多種功效[8]。研究證實，對黃花蒿采用不同的提取方法和各種有機溶劑進行提取，提取物對多種細菌，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單核增多性李氏桿菌和白色念珠菌等均有不同程度的抑菌作用[9-10]。另有一些研究結(jié)果顯示黃花蒿的有機溶劑提取物對許多植物性病原真菌具有顯著的抑制作用[11-14]。本實驗以水蒸氣蒸餾法，提取黃花蒿揮發(fā)油，研究其對幾種常見細菌和真菌的抑制作用，測定最低抑菌濃度，以期為黃花蒿的綜合利用和天然食品防腐劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

野生黃花蒿采自吉林省白城市近郊，經(jīng)東北師范大學生命科學學院肖洪興教授鑒定為菊科植物(Artemisia annua L.)。

1.2 供試菌種

細菌：變形桿菌(Proteusbacillus vulgaris)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、四聯(lián)球菌(Micrococcus tetragenus)、產(chǎn)氣桿菌(Clostridium perfringens)和糞便鏈球菌(Fecal streptococcus)；真菌：根霉(Rhizopus spl.)、青霉(Penicillium sp.)、毛霉(Mucor racemosus)、馬青霉(Penicillium marneffei)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)、黑曲霉(Aspergillus niger)和啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，均由東北師范大學生命科學學院微生物實驗室提供。

1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(細菌用)；沙保培養(yǎng)基(真菌用)，121℃高壓滅菌20min，備用。

1.4 儀器與設(shè)備

揮發(fā)油提取器 上海亞榮生化儀器廠；YXQ.SG41.280型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海醫(yī)療器械工業(yè)公司江陰醫(yī)療設(shè)備廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械一廠；AY220電子天平 日本島津公司。

1.5 方法

1.5.1 黃花蒿揮發(fā)油的制備

取黃花蒿全草的鮮品，水蒸氣蒸餾法提取得到淡黃色油脂，即為黃花蒿揮發(fā)油。黃花蒿揮發(fā)油用吐溫-80乳化，再溶解于一定體積的水中，配制成6.25～50.0mg/mL不同質(zhì)量濃度的溶液，于冰箱中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 紙片法測定抑菌效果

用打孔器將干凈的濾紙制成直徑為0.5cm的小圓紙片，干熱滅菌后，分別浸入不同質(zhì)量濃度的溶液中，使其充分吸收，備用。在超凈臺里將轉(zhuǎn)接后生長良好的菌種試管斜面注入適量無菌水，制成菌懸液，注入平板，涂布均勻。將浸泡處理過的濾紙片瀝干，貼在上述含菌平板上，每個平板貼3片相同黃花蒿揮發(fā)油質(zhì)量濃度的濾紙片。吐溫-80和無菌水的混合液作為空白對照，重復實驗2次。置于培養(yǎng)箱中，細菌37℃培養(yǎng)24h，真菌28℃培養(yǎng)48h。取出量取抑菌圈直徑，測量實驗結(jié)果，取平均值。

1.5.3 試管法測定最低抑菌濃度(MIC)

根據(jù)濾紙片法所得的結(jié)果，參照文獻[15]，采用試管法對各受試菌種進行最低抑菌濃度測定(MIC)。 培養(yǎng)基以每管總體積5mL分裝于試管中，121℃、0.1MPa條件下滅菌20min。當滅菌培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時，加入黃花蒿揮發(fā)油，倍比稀釋成0.3125～20.0mg/mL梯度質(zhì)量濃度，充分混勻，無菌水作對照，分別制成斜面。取生長良好的受試菌劃線接種于斜面上。細菌放于37℃ 溫箱中培養(yǎng)，觀察24h菌落生長狀態(tài)。真菌放于28℃溫箱中培養(yǎng)，觀察48h菌落生長狀態(tài)。取完全不生長管樣品最低質(zhì)量濃度為最低抑菌濃度(MIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度黃花蒿揮發(fā)油抑菌效果

用吐溫-80和無菌水配制50.0、25.0、12.5、6.25、3.125mg/mL的揮發(fā)油溶液，采用濾紙片擴散法測定抑菌圈直徑。結(jié)果見表1。

由表1可知，黃花蒿揮發(fā)油對供試的5種細菌、7種真菌都有較強的抑菌活性。供試菌種中，既有細菌又有真菌，而且黃花蒿揮發(fā)油對革蘭氏陽性和陰性菌均有不同的抑制作用。與細菌比較，真菌對黃花蒿揮發(fā)油較為敏感。因此，黃花蒿揮發(fā)油具有廣泛的抑菌作用。

表1 黃花蒿揮發(fā)油的抑菌活性(抑菌圈直徑)測定結(jié)果Table 1 Inhibition zone diameters of the essential oil from Artemisia annua against 12 test strainsmm

2.2 最低抑菌濃度(MIC)的測定

用培養(yǎng)基配制20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/mL的黃花蒿揮發(fā)油溶液，采用試管法測定樣品MIC，取完全不生長管樣品最小質(zhì)量濃度作為最低抑菌濃度，結(jié)果見表2。

表2 黃花蒿揮發(fā)油最低抑菌濃度(MIC) Table 2 MICs of the essential oil from Artemisia annua against 12 test strains

由表2可以看出，黃花蒿揮發(fā)油對真菌的抑制效果顯著高于細菌，黃花蒿揮發(fā)油對真菌的MIC＜2.5mg/mL，而對細菌的MIC＜10mg/mL，此結(jié)果與濾紙片法結(jié)果相一致。

3 討 論

通過本實驗結(jié)果可以看出，隨著質(zhì)量濃度的增大，黃花蒿揮發(fā)油對供試菌種的抑菌效果均呈上升趨勢。黃花蒿揮發(fā)油對受試菌種都有很強的抑菌作用，對真菌生長的抑制作用要顯著強于對細菌生長的抑制作用。在真菌中，黃花蒿揮發(fā)油對黑曲霉的生長抑制最強，在50.0mg/mL時，抑菌圈是17.2mm，對啤酒酵母菌和產(chǎn)黃青霉的生長也有明顯抑制作用，在50.0mg/mL時，抑菌圈直徑分別為15.8mm和15.0mm；對青霉和毛霉的抑制作用稍弱，抑菌圈分別為12.8mm和11.8mm。抑菌效果順序為：黑曲霉＞啤酒酵母菌＞產(chǎn)黃青霉＞馬青霉＞毛霉＞青霉＞根霉。黃花蒿揮發(fā)油對真菌的MIC為1.25～2.5mg/mL。

黃花蒿揮發(fā)油對細菌的抑制作用相對較弱，在50.0mg/mL時，糞便鏈球菌和四聯(lián)球菌的抑菌圈分別為9.8mm，變形桿菌生長受黃花蒿揮發(fā)油的影響不顯著，在50.0mg/mL時有抑菌圈，為7.2mm。抑菌效果順序為：糞便鏈球菌＞四聯(lián)球菌＞產(chǎn)氣桿菌＞枯草桿菌＞變形桿菌。黃花蒿揮發(fā)油對真菌的MIC大多為5mg/mL，而變形桿菌對黃花蒿揮發(fā)油的敏感性較弱，MIC為10mg/mL。

黃花蒿揮發(fā)油對受試菌種的抑菌作用基本一致，對真菌作用抑制較強，對細菌的抑菌活性相對較差。已有研究證實，黃花蒿揮發(fā)油中萜類和半萜類化合物含量高達90%以上[16-19]，萜類化合物在生活中常被用作食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥和食品添加劑、動物添加劑等，由于其功能特殊、用途廣泛，開發(fā)前景十分廣闊，在國際上已逐漸成為研究熱點。而且，黃花蒿揮發(fā)油的抑菌作用并非單一化合物的活性，可能是多種成分的協(xié)同作用。為了進一步了解黃花蒿揮發(fā)油活性物質(zhì)的抑菌機理，可對提取物進行分離純化，深入探討其活性物質(zhì)的抑菌機理及其構(gòu)效關(guān)系。黃花蒿在我國資源豐富、產(chǎn)量高，其揮發(fā)油對細菌、真菌具有較好的抑制作用，作為中藥資源有必要對其進行更深入的抑菌活性實驗，為天然抗菌藥物和食品防腐劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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in vitro Antimicrobial Activity of Essential Oil from Artemisia annua

GAO Zhi-ling，CHEN Yan，XIE Ying-hui
(Baicheng Medical College, Baicheng 137000, China)

The essential oil extracted from Artemisia annua by steam distillation was determined for its in vitro antibacterial activity (inhibition zone diameter) by disk diffusion method and minimum inhibitory concentration (MIC) by test tube method. Twelve species of common bacteria or fungi were the indicator strains used. The essential oil had different inhibitory effects on these test strains. Comparatively, fungi were more sensitive to the oil, and its anti-fungus activity was stable, and it had the strongest inhibitory effect on Aspergillus niger, followed by Saccharomyces cerevisiae, Penicillium chrysogenum, Penicillium marneffei, Mucor racemosus, Penicillium sp. and Rhizopus sp. Thus, the essential oil has broad application prospects for the development of a natural preservative or an antimicrobial drug.

Artemisia annua；essential oil；fungi；bacteria；minimum inhibitory concentration

Q936

A

1002-6630(2010)19-0209-03

2010-05-10

高志玲(1971—)，女，講師，碩士，主要從事病原生物學和免疫學。E-mail：gaozl3669@163.com