王淑軍，呂明生，李華鐘，徐金利,，焦豫良，房耀維，劉 姝

深海古菌Thermococcus siculi HJ21高溫普魯蘭酶基因的克隆及表達(dá)

王淑軍1，呂明生1，李華鐘2，徐金利1,2，焦豫良1，房耀維1，劉 姝1

(1.淮海工學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.江南大學(xué) 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇 無錫 214122)

根據(jù)NCBI上公布的普魯蘭酶基因的保守序列設(shè)計簡并引物，以Thermococcus siculi HJ21基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，得到T. siculi HJ21普魯蘭酶的基因，測序后通過Blast(NCBI)數(shù)據(jù)庫比對和分析表明擴(kuò)增基因有一個4056bp、編碼1351個氨基酸的開放閱讀框，為一新的普魯蘭酶基因。將該基因插入表達(dá)載體pET28a，并轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，測定普魯蘭酶比活力。重組轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞破碎液有高溫普魯蘭酶活性，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示出分子質(zhì)量約為150kD的特異性條帶。

Thermococcus siculi HJ21；普魯蘭酶；基因；PCR

普魯蘭酶(pullulanase，EC 3.2.1.41) 是一種能夠?qū)Ｒ恍运馄蒸斕m多糖和其他多糖如淀粉、糖原和極限糊精中的α-1,6糖苷鍵，從而剪下整個側(cè)枝，形成直鏈淀粉的脫支酶[1-2]。它在淀粉加工工業(yè)中有著非常重要的用途，可大規(guī)模地提高淀粉的利用率和生產(chǎn)效率[3-4]。普魯蘭酶可以單獨(dú)使用，亦可與其他酶配合使用，相輔相成收到良好的效果[5-7]。該酶已被較成熟地應(yīng)用于高葡萄糖漿、高麥芽糖漿和干啤酒生產(chǎn)中[8-9]。目前我國對于該酶的研究還處于實(shí)驗室研究階段，因此無此酶的生產(chǎn)技術(shù)，普魯蘭酶制品主要依賴進(jìn)口[10]。

來自嗜熱菌Thermococcus siculi HJ21的耐高溫普魯蘭酶的最適反應(yīng)溫度為95℃，且溫度的穩(wěn)定性較好，因而具有較高的工業(yè)應(yīng)用價值。本實(shí)驗利用分子生物學(xué)技術(shù)，克隆T. siculi HJ21的普魯蘭酶基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，以為該酶的工業(yè)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

Thermococcus siculi HJ21、Escherichia coli DH5α、E. coli BL21(DE3)為淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗室保藏。T-A克隆載體pMD18-T TaKaRa(大連)公司；pET28a表達(dá)載體由中國科學(xué)院海洋研究所秦松研究員饋贈。

1.1.2 酶與試劑

DNA聚合酶、氨芐青霉素、膠回收試劑盒 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、 Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 寶生物工程(大連)有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

大腸桿菌的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基(液體LB培養(yǎng)基：每升含10g胰蛋白胨、5g酵母粉、10g NaCl；固態(tài)LB培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加0.02g/mL瓊脂粉)，37℃培養(yǎng)。T. siculi HJ21的培養(yǎng)用自行設(shè)計的厭氧培養(yǎng)裝置，培養(yǎng)基為改良的YPS培養(yǎng)基按參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行配制。

1.1.4 引物合成和測序

引物合成和測序均由上海生工生物工程服務(wù)有限公司完成。引物序列及用途見表1。

表1 克隆T. siculi HJ21高溫普魯蘭酶全長DNA所用引物Table 1 Primers used for the cloning of full-length DNA of T. siculi HJ21 pullulanase gene

1.2 方法

1.2.1 T. siculi HJ21 高溫普魯蘭酶基因的克隆

1.2.1.1 T. siculi HJ21基因組總DNA的制備

基因組總DNA的提取采用TaKaRa公司的試劑盒Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0進(jìn)行提取。

1.2.1.2 部分DNA序列的PCR

根據(jù)已報道的普魯蘭酶基因保守區(qū)設(shè)計簡并引物(F1、R1、F2、R2、F3、R3、F4、R4)。PCR反應(yīng)體系(25μL)的組成為：10×buffer 2.5μL、Mg2+(25mmol/L) 2.5μL、引物1(P1)，100μmol/L) 0.5μL、引物2(P2)，100μmol/L) 0.5μL、dNTP(10mmol/L) 0.5μL、Taq酶 (5U/μL) 0.2μL、模板1μL、ddH2O定容至25 μL。PCR按照如下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃預(yù)變性4min，然后進(jìn)入以下循環(huán)：94℃變性1min；54℃退火40s；72℃延伸，共進(jìn)行35個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10min，4℃保存。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物以0.01g/mL 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析、膠回收(膠回收參閱上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司上海生工公司的小量膠回收試劑盒說明書，凝膠的制備和操作參照文獻(xiàn)[12]，并克隆到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，藍(lán)白斑篩選和酶切鑒定陽性克隆，挑選正確的陽性克隆測序。

1.2.1.3 序列拼接

將簡并引物所獲得的部分DNA序列用DNAMAN Version6.0進(jìn)行序列拼接，結(jié)合測序峰圖進(jìn)行序列校正，最后獲得拼接好的序列，見圖1。

圖1 DNA序列拼接Fig.1 DNA fragment assembly

1.2.1.4 全長DNA的擴(kuò)增

根據(jù)序列拼接結(jié)果設(shè)計兩端引物F5和R5，按94℃預(yù)變性4min；然后94℃ 40s，56℃ 40s，72℃ 4min，35個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物以0.007g/mL脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析和膠回收，并克隆到pMD18-T載體上構(gòu)建得到新質(zhì)粒pMD18-T-pull，并轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，藍(lán)白斑篩選和酶切鑒定陽性克隆，提取的質(zhì)粒pMD18-T-pull凍存，20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 目的基因的表達(dá)及活性鑒定

1.2.2.1 大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

提取含有T. siculi HJ21普魯蘭酶基因的質(zhì)粒pMD18-T-pull，用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，回收并與以同樣雙酶切的pET28a質(zhì)粒以3:1的物質(zhì)的量比進(jìn)行混合連接，構(gòu)建得到新質(zhì)粒pET28a-pull，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，以Amp+篩選陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒pET28a-pull凍存－20℃?zhèn)溆?。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化按文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行操作。大腸桿菌工程菌的誘導(dǎo)按文獻(xiàn)[14]方法進(jìn)行操作。

1.2.2.2 普魯蘭酶比活力測定

粗酶液制備：將發(fā)酵液用三層濾紙抽濾除去殘余硫顆粒及雜質(zhì)后，以10000r/min離心15min，除去菌體，取上清液鹽析過夜，每100mL上清液加39.6g硫酸胺，然后再以11000r/min離心30min，取沉淀透析，透析結(jié)束后以12000r/min離心10min，除去雜質(zhì)，所得上清液即為粗酶液，置于－40℃冰箱保存。

將50μL粗酶液加入到150μL普魯蘭乙酸鈉緩沖液(200mmol/L，pH6.0)中，在95℃水浴中反應(yīng)15min，用DNS測定還原糖量[15]。在上述條件下，每分鐘催化底物產(chǎn)1μmol麥芽糖的酶量作為一個酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 T. siculi HJ21普魯蘭酶基因的擴(kuò)增及序列分析

圖2 簡并引物擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 Electrophoresis of the PCR products of pulluanase gene with four pairs of degenerate primers

根據(jù)NCBI中公布的耐高溫普魯蘭酶序列，利用ClustalX軟件對序列進(jìn)行對比，找到保守氨基酸序列，設(shè)計簡并引物進(jìn)行PCR，獲得長度約為280、2300、200bp及2000bp的片段，結(jié)果見圖2。將片段回收后，測序結(jié)果顯示所擴(kuò)增得到的片段經(jīng)拼接后全長為4056bp，編碼1351個氨基酸。然后根據(jù)拼接后的序列設(shè)計引物擴(kuò)增普魯蘭酶基因，并與pMD18-T相連，獲得pMD18-T-pull質(zhì)粒，結(jié)果見圖3。通過其編碼的氨基酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中用Blast(Basic Local Alignnlentsemh Tool)進(jìn)行相似性搜索比對可以看出，T. siculi HJ21與T. hydrothermalis AL662 (AF068255)的親緣關(guān)系最近，堿基序列的相似性達(dá)到82%，氨基酸序列的相似性達(dá)到87%。

圖3 普魯蘭酶編碼基因Fig.3 Electrophoresis of the full-length PCR products of pulluanase gene

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和酶切驗證

將pMD18-T-pull進(jìn)行BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，電泳膠回收4.0kb左右的條帶，對pET28a質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，電泳膠回收5.3kb的條帶；將上述膠回收產(chǎn)物以3:1的物質(zhì)的量比進(jìn)行混合，構(gòu)建過程見圖4。

圖4 pET-28a-pull的構(gòu)建Fig.4 Construction map of recombinant expressing vector pET-28apull

圖5 pET-28a-pull經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切Fig.5 Double enzymatic digestion identification of pET-28a-pull with BamHⅠ and SalⅠ

將重組質(zhì)粒 pET28a-pull用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，酶切后于0.007g/mL的瓊脂糖凝膠中電泳驗證，電泳結(jié)果顯示產(chǎn)生4.0kb和5.3kb兩條帶，證明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確，結(jié)果見圖5。

2.3 普魯蘭酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)

將pET28a、pET28a-pull分別轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)，轉(zhuǎn)化子接種于含有50μg/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期后期，加入IPTG，使其終濃度為1mmol/L，于37℃條件下誘導(dǎo)4h后離心收集菌體用緩沖液洗滌懸浮，于冰水中超聲破碎細(xì)胞，測定酶比活力。結(jié)果表明，普魯蘭酶基因在大腸桿菌中成功表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后普魯蘭酶基因在大腸桿菌中得到了較好的表達(dá)，150kD附近出現(xiàn)了明顯的蛋白條帶，表達(dá)蛋白占細(xì)胞總蛋白的8%，結(jié)果見圖6。

圖6 重組酶液SDS-PAGEFig.6 SDS-PAGE of recombinant pullulanase

3 討 論

該研究實(shí)現(xiàn)了普魯蘭酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)，表達(dá)采用了T7強(qiáng)啟動子，但酶的表達(dá)水平不高，全細(xì)胞蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，含重組質(zhì)粒的細(xì)胞和含pET28a空載體的細(xì)胞用IPTG誘導(dǎo)后所獲電泳圖譜并沒有明顯差別，這說明重組蛋白的表達(dá)量不高。利用一個在線分析大腸桿菌稀有密碼子的網(wǎng)站http://nihserver. mbi.ucla.edu/RACC/分析T. siculi HJ21普魯蘭酶基因中的稀有密碼子，共有稀有密碼子99個，其中稀有精氨酸密碼子有28個，稀有亮氨酸密碼子有4個，稀有異亮氨酸密碼子有41個，稀有脯氨酸密碼子有26個，而在大腸桿菌稀有密碼子的tRNA中，以tRNAArg (AGG/ AGA)含量最低，對表達(dá)的影響也最大，因而顯著影響表達(dá)水平。

來源于T. siculi HJ21的普魯蘭酶由于其反應(yīng)溫度高、對Ca2+依賴性小、酶的穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，因而受到越來越多的關(guān)注。但由于超嗜熱微生物生長環(huán)境的特殊性(高壓、厭氧以及低營養(yǎng))，利用傳統(tǒng)的生物發(fā)酵技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)超嗜熱微生物的工業(yè)生產(chǎn)。因此，目前主要通過基因工程的手段把優(yōu)良的酶基因在適宜的宿主系統(tǒng)中進(jìn)行高效表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)嗜熱酶的工業(yè)應(yīng)用。本實(shí)驗利用分子生物學(xué)手段，展現(xiàn)了來源于T. siculi HJ21的普魯蘭酶基因的表達(dá)，為該酶的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。近年來雖然已經(jīng)將嗜熱普魯蘭酶在不同的宿主中表達(dá)成功，但是表達(dá)量比較低，因此，可以通過分子定向進(jìn)化技術(shù)提高其表達(dá)量，以滿足工業(yè)應(yīng)用的要求。

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Cloning and Expression of a New Thermostable Pullulanase Gene from a Deep-sea Archaeaon Strain Thermococcus siculi HJ21

WANG Shu-jun1，LU Ming-sheng1，LI Hua-zhong2，XU Jin-li1,2，JIAO Yu-liang1，F(xiàn)ANG Yao-wei1，LIU Shu1
(1. College of Food Science and Technology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China；2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The gene of pullulanase was amplified from Thermococcus siculi HJ21 with degenerate primes designed based on the NCBI published conserved sequence information. The DNA sequencing and BLAST (NCBI) analysis showed that this DNA sequence was a new pullulanase gene with an open reading frame (ORF) of 4056 bp in length encoding 1351 amino acids．The gene was cloned into the expression vector, pET28a, producing a hybrid plasmid pET28a-pull. Subsequently, pET28a-pull was introduced into Escherichia coli BL21(DE3). The lysate of the transformant cells showed thermostable pullulanase activity. The SDS-PAGE analysis showed a band with apparent molecular weight of 150 kD.

Thermococcus siculi HJ21；pullulanase；gene；PCR

Q936；Q814

A

1002-6630(2010)19-0309-04

2010-06-08

國家自然科學(xué)基金項目(40746030)；江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項目(09KJA170001)

王淑軍(1965—)，女，教授，博士，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：shujunwang86@hotmail.com