朱 姁，潘道東,2,*

發(fā)酵乳桿菌細(xì)胞壁蛋白酶的提取

朱 姁1，潘道東1,2,*

(1.南京師范大學(xué) 國(guó)家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

確定提取發(fā)酵乳桿菌細(xì)胞壁蛋白酶的最佳方法和最佳提取條件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用多指標(biāo)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和綜合平衡分析法研究溶菌酶結(jié)合非離子表面活性劑法提取發(fā)酵乳桿菌細(xì)胞壁蛋白酶的裂解液成分和提取條件。結(jié)果表明：裂解液的成分為50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、體積分?jǐn)?shù)3%吐溫-20、2mg/mL溶菌酶、pH8.9；提取條件為裂解液與菌體的比例10:1(V/m)、保溫時(shí)間5h、保溫溫度37℃時(shí)酶比活力達(dá)38.957U/mg，此時(shí)可最大效率的獲得發(fā)酵乳桿菌的細(xì)胞壁蛋白酶。

發(fā)酵乳桿菌；細(xì)胞壁蛋白酶；提取

據(jù)專家推測(cè)，2025年全世界將有超過(guò)15億高血壓患者。在高血壓人群中有95%以上的患者屬于原發(fā)性高血壓，利用酶學(xué)或微生物發(fā)酵技術(shù)制備血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(angiotensin Ⅰ-converting enzyme，ACE)抑制肽或制成相應(yīng)的食品，且具有有效降低原發(fā)性高血壓的效果，且相對(duì)于合成降壓藥更安全可靠、無(wú)副作用。研究發(fā)現(xiàn)一些乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中分泌的蛋白酶能分解乳蛋白產(chǎn)生多肽，對(duì)ACE具有抑制作用[1-3]。細(xì)胞壁蛋白酶(cellenvelope proteinase，CEP)是乳酸菌蛋白水解過(guò)程中的第一個(gè)酶，扮演了一個(gè)非常重要的角色，前人用純化的CEP水解乳蛋白發(fā)現(xiàn)，CEP可以單獨(dú)水解乳蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽，所以，對(duì)于CEP的研究至關(guān)重要，但是現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外對(duì)CEP的研究主要是乳球菌類，乳桿菌類也僅限于瑞士乳桿菌，本實(shí)驗(yàn)將嘗試從發(fā)酵乳桿菌中提取CEP。目前CEP的提取方法主要是Ca2+-free法，Yamamoto等[4]采用此法提取了Lactobacillus helveticus CP790的CEP；本實(shí)驗(yàn)室郭宇星等[5]采用過(guò)超聲波處理法提取瑞士乳桿菌的CEP；Coolbeard等[6]用溶菌酶處理法從Lactococcus lactis subsp. cremoris H2中提取到了CEP；Martin-Hernandez等[7]采用Triton X-100和NP-40共同處理Lactobacillus helveticus L89細(xì)胞壁，抽提出CEP。本實(shí)驗(yàn)將采用以上3種方法提取發(fā)酵乳桿菌CEP，并且對(duì)相對(duì)較好的方法進(jìn)一步優(yōu)化改進(jìn)，最大效率的從發(fā)酵乳桿菌中獲得CEP，以進(jìn)一步研究其酶學(xué)性質(zhì)及對(duì)乳蛋白的水解度和ACE抑制活性。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)由本實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

考馬斯亮藍(lán)G-250 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白 南京賽吉科技有限公司；MeOsuc-Arg-Pro-Tyr-pNA(MS-Arg) 北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；溶菌酶(酶活力＞20000U/mg) 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250A生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；超凈工作臺(tái) 上海上凈凈化食品有限公司；PHS-3C精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；722-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；CL-22M高速冷凍離心機(jī) 賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 菌體制備

菌體在固體培養(yǎng)基上連續(xù)活化三代，再接入液體培養(yǎng)基中，按體積分?jǐn)?shù)3%接種量，37℃條件下擴(kuò)大培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期(16h)取出，4℃、4500r/min離心20min收集菌體沉淀。用含有30mmol/L Ca2+的50mmol/L Tris-HCl (pH7.1)緩沖液洗滌菌體[5]，4℃、4500r/min離心20min，棄上清液，重復(fù)洗滌3次，收集菌體備用。

1.3.2 酶液提取方法[8]

Ca2+-free法：取菌體2g，用含有2mmol/L EDTANa2的50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)10mL重新懸浮菌體，攪勻，在30℃保溫30min，于4℃、4500r/min離心20min，取上清液即為粗酶液。

溶菌酶裂解法：取菌體2g，用裂解液(50mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA-Na2、100mmol/L NaCl、體積分?jǐn)?shù)0.5%Triton X-100、1mg/mL溶菌酶，pH8.5)40mL懸浮菌體，37℃保溫3h，于4℃、4500r/min離心20min，上清液即為粗酶液。

超聲波破碎法：取菌體2g，用50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.1)10mL重新懸浮菌體，攪勻，進(jìn)行超聲波破碎，超聲波破碎條件為破碎功率300W、破碎時(shí)間3s、間隔時(shí)間5s、200次。取破碎液于4℃、4500r/min離心20min，取上清液即為粗酶液。

1.3.3 CEP酶活力測(cè)定[9]

取0.02mL底物MeOsuc-Arg-Pro-Tyr-pNA(MS-Arg) (16.4mmol/L)，酶液0.04mL，1.14mL Tris-HCl緩沖液(50mmol/L，pH7.8)混合，在37℃保溫60min。用0.5mL、體積分?jǐn)?shù)30%乙酸終止反應(yīng)，在410nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(測(cè)定時(shí)補(bǔ)充2.3mL蒸餾水)。空白對(duì)照管，以蒸餾水代替酶液同樣條件操作。

酶活力單位定義：37℃，每小時(shí)A410nm增加0.10定義為一個(gè)酶活力單位(U/mL)。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定[10]

采用考馬斯亮藍(lán)法。取0.1mL樣品、0.9mL蒸餾水、5mL蛋白試劑(100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50mL 95%乙醇中，再加100mL 85%磷酸，用雙蒸水補(bǔ)至1000mL)，充分振蕩混勻，5min后于波長(zhǎng)595nm處測(cè)定吸光度，以1mL重蒸水作為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的確定

Haandrikman等[11]報(bào)道提取乳球菌CEP的方法一般都采用Ca2+-free法，此法中加入的EDTA-Na2可以螯合蛋白酶上的Ca2+，Ca2+可以穩(wěn)定CEP的結(jié)構(gòu)，一旦Ca2+缺失，乳球菌細(xì)胞壁蛋白酶結(jié)構(gòu)就會(huì)改變，CEP就會(huì)從細(xì)胞壁上解離下來(lái)。但在本實(shí)驗(yàn)中采用Ca2+-free法提取發(fā)酵乳桿菌的CEP效果不是很好，說(shuō)明發(fā)酵乳桿菌的CEP和乳球菌的CEP結(jié)構(gòu)可能存在某些不同。CEP的C-末端含有一段疏水性殘基序列(transmembrane，TM)，其主要功能是錨定在細(xì)胞壁上或者細(xì)胞膜上[12-13]。有研究報(bào)道，采用Ca2+-free法提取出的蛋白酶只是暴露在細(xì)胞壁外的N-端序列，所以提取率不高[7]。若要獲得較高提取率，就必須破碎細(xì)胞膜，常用的破壁方法有超聲波處理法、溶菌酶處理法和表面活性劑處理法等。于是本實(shí)驗(yàn)嘗試了溶菌酶結(jié)合表面活性劑處理法和超聲波處理法提取發(fā)酵乳桿菌的CEP，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 CEP提取方法比較Table 1 Comparison among three methods for the extraction of cellenvelope protainase

從表1可以看出，同樣是2g菌體，溶菌酶裂解法可以獲得更高含量的CEP，所以可能是超聲波破碎法破碎程度過(guò)于劇烈不適宜提取發(fā)酵乳桿菌的CEP，而采用溶菌酶處理菌體的方式則比較合適。

2.2 溶菌酶裂解法提取CEP

2.2.1 裂解液成分的單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 溶菌酶質(zhì)量濃度對(duì)CEP提取的影響

圖1 溶菌酶質(zhì)量濃度對(duì)CEP提取的影響Fig.1 Effect of lysozyme concentration on the extraction of cellenvelope protainase

溶菌酶通過(guò)水解菌體細(xì)胞壁的肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵破壞細(xì)胞壁[6]，溶菌酶的質(zhì)量濃度直接關(guān)系到CEP的釋放，結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)當(dāng)溶菌酶質(zhì)量濃度達(dá)到2mg/mL時(shí)，CEP的釋放量基本達(dá)到最大。

2.2.1.2 EDTA-Na2濃度對(duì)CEP提取的影響

EDTA-Na2除了可以螯合蛋白酶上的Ca2+，改變CEP的構(gòu)象外，還對(duì)細(xì)菌細(xì)胞外層膜有破壞作用。細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)通?？慷r(jià)陽(yáng)離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來(lái)維持，一旦EDTA-Na2將離子螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞外層膜出現(xiàn)洞穴，而CEP的C-末端又錨定于細(xì)胞膜上，外層膜的破壞直接導(dǎo)致蛋白酶的脫離。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 EDTA-Na2濃度對(duì)CEP提取的影響Fig.2 Effect of EDTA-Na2concentration on the extraction of cellenvelope protainase

由圖2可知，對(duì)于提取發(fā)酵乳桿菌CEP，EDTANa2的作用并不大，甚至當(dāng)濃度達(dá)到一定程度時(shí)還會(huì)抑制CEP的活性。查文獻(xiàn)[14]可知，EDTA會(huì)抑制金屬蛋白酶的活性，據(jù)此可初步推斷CEP可能是金屬蛋白酶，而且這也可能就是Ca2+-free法對(duì)發(fā)酵乳桿菌CEP提取效率不高的主要因素之一。

2.2.1.3 非離子表面活性劑對(duì)CEP提取的影響

圖3 非離子表面活性劑對(duì)CEP提取的影響Fig.3 Effect of nonionic surfactant type on the extraction of cellenvelope protainase

非離子表面活性劑也會(huì)促進(jìn)CEP的釋放，其對(duì)疏水性物質(zhì)有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，因此其作用主要是破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，可以使CEP的C-末端從細(xì)胞膜上脫落下來(lái)。而且非離子表面活性劑對(duì)蛋白的變性作用影響較小，其影響可以通過(guò)Sephadex LH-50除去，也可直接上DEAE-Sephadex層析分離目的蛋白，不必除去非離子表面活性劑。本實(shí)驗(yàn)比較了幾種非離子表面活性劑對(duì)提取酶的影響，添加量均為體積分?jǐn)?shù)0.5%，結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢?jiàn)添加Tween-20更有利于CEP的釋放。

2.2.1.4 Tween-20添加量對(duì)CEP提取的影響

Tween-20有復(fù)性抗原的作用，可提高特異性的識(shí)別能力，且相對(duì)于其他類型的Tween要更溫和一些，其添加量對(duì)提取CEP的影響見(jiàn)圖4。可見(jiàn)，Tween-20的添加量在達(dá)到2%時(shí)酶活力已經(jīng)趨于平衡了。

圖4 Tween-20添加量對(duì)CEP提取的影響Fig.4 Effect of Tween-20 concentration on the extraction of cellenvelope protainase

2.2.1.5 NaCl濃度對(duì)CEP提取的影響

圖5 NaCl濃度對(duì)CEP提取的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration on the extraction of cell-envelope protainase

少量離子的作用，可以減少蛋白質(zhì)分子極性基團(tuán)之間的靜電引力，加強(qiáng)蛋白質(zhì)與提取液之間的相互作用，從而促進(jìn)溶解[15]。由圖5可見(jiàn)，NaCl濃度達(dá)到150mmol/L時(shí)，CEP的提取效果更顯著。

2.2.1.6 pH值對(duì)CEP提取的影響

提取液的pH值應(yīng)在酶的穩(wěn)定pH值范圍內(nèi)，并應(yīng)遠(yuǎn)離其等電點(diǎn)的pH值，使蛋白質(zhì)分子帶上凈電荷，以增大其溶解度[15]。從文獻(xiàn)[13]查得CEP的pI值為4.5，且根據(jù)前人用溶菌酶法提取CEP的經(jīng)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)選用8.0、8.5、8.9進(jìn)行正交試驗(yàn)，比較不同pH值對(duì)CEP提取的影響。

2.2.1.7 裂解液成分的正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，確定了裂解液成分正交試驗(yàn)的幾種考察因素及水平，以酶比活力(酶比活力=酶活力/蛋白質(zhì)含量)為指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 裂解液成分的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Arrangement and experimental results of the orthogonal array design for optimizing the composition and pH of cell lysis solution

綜合分析表2可知，A、B、C、D四因素中，因素B、A是最重要的，且都是第3水平最優(yōu)，這反映出非離子表面活性劑(Tween-20)和溶菌酶是裂解液最關(guān)鍵的兩個(gè)因素，另外兩個(gè)因素的影響相對(duì)小一些。以酶比活力為指標(biāo)，得出裂解液影響CEP提取的程度大小順序?yàn)門ween-20添加量＞溶菌酶＞pH值＞NaCl，極差分析得出最優(yōu)水平組合是A3B3C2D3，而9個(gè)試驗(yàn)組中最佳組合條件為A3B3C2D1，經(jīng)驗(yàn)證A3B3C2D3組合條件下所得酶比活力為26.438U/mg，效果更好。因此，確定提取發(fā)酵乳桿菌CEP的裂解液成分為：50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、3% Tween-20、2mg/mL溶菌酶、pH8.9。

2.2.2 CEP提取條件的優(yōu)化

2.2.2.1 裂解液與菌體的比例

圖6 裂解液與菌體的比例對(duì)CEP提取的影響Fig.6 Effect of cell lysis solution/ Lactobacillus fermentum cells ratio on the extraction of cell-envelope protainase

由圖6可知，在裂解液與菌體的比例在10:1時(shí)，CEP的酶比活力達(dá)到最大。

2.2.2.2 保溫時(shí)間

圖7 保溫時(shí)間對(duì)細(xì)胞壁蛋白酶提取的影響Fig.7 Effect of incubation time on the extraction of cell-envelope protainase

由圖7可知，隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，CEP蛋白酶活力基本呈增大趨勢(shì)，4.5h時(shí)蛋白酶活力達(dá)到最大。

2.2.2.3 保溫溫度

圖8 保溫溫度對(duì)CEP提取的影響Fig.8 Effect of incubation temperature on the extraction of cellenvelope protainase

由圖8可知，隨著溫度的上升，酶活力、蛋白質(zhì)含量、酶比活力都呈增大趨勢(shì)，當(dāng)保溫溫度為41℃時(shí)，蛋白質(zhì)釋放量基本趨于平衡，酶活力和酶比活力都達(dá)到最大值。

2.2.2.4 提取條件正交試驗(yàn)的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，確定了提取條件正交試驗(yàn)的幾種考察因素及水平，以酶比活力為指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3的極差可以看出，各個(gè)因素影響CEP提取的大小順序?yàn)榱呀庖号c菌體的比例＞保溫時(shí)間＞保溫溫度，通過(guò)直觀分析得出最優(yōu)水平組合是A2B3C1，而9個(gè)試驗(yàn)組中最佳組合也為A2B3C1。因此，確定提取發(fā)酵乳桿菌CEP的提取條件為：裂解液與菌體的比例10:1、保溫時(shí)間5h、保溫溫度37℃，在該條件下所得酶比活力為38.957U/mg。

表3 提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Arrangement and experimental results of the orthogonal array design for optimizing three extraction conditions

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)確定了從發(fā)酵乳桿菌中提取CEP的方法：用裂解液(50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、體積分?jǐn)?shù)3% Tween-20、2mg/mL溶菌酶、pH8.9)懸浮菌體(10:1)，37℃保溫5h，于4℃、4500r/min離心20min后取上清液即為粗酶液。本實(shí)驗(yàn)確立了溶菌酶結(jié)合非離子表面活性劑法提取發(fā)酵乳桿菌CEP的基本實(shí)驗(yàn)路線，方法簡(jiǎn)便，所得酶活力也較高。關(guān)于發(fā)酵乳桿菌細(xì)胞壁蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及特性還有待于進(jìn)一步研究。

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Extraction of Cell-envelope Proteinase from Lactobacillus fermentum

ZHU Xu1，PAN Dao-dong1,2,*
(1. Branch of National Dairy Products Processing Technology Developing Center, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Lysozyme treatment was selected out of three commonly used ways for extracting cell-envelope protainase from Lactobacillus fermentum cells in the present study. The composition and pH of cell lysis solution and three extraction conditions were optimized using orthogonal array design. The best cell lysis solution was a mixture of 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, 3% Tween-20 and 2 mg/mL lysozyme at pH 8.9. Cell lysis solution/ Lactobacillus fermentum cells ratio of 10:1 (V/m) and incubation time of 5 h at a constant temperature of 37 ℃ were found optimal for the extraction of cell-envelope protainase, and the maximum specific enzyme activity was up to 38.957 U/mg under these conditions.

Lactobacillus fermentum；cell-envelope proteinase；extraction

TS201.3

A

1002-6630(2010)19-0268-05

2010-01-28

朱姁(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：jsdfzhuxu@hotmail.com

*通信作者：潘道東(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工。E-mail：daodongpan@126.com