涂紹勇，李鳳嬌，楊愛華

微生物轉(zhuǎn)化沙棘黃酮苷生成黃酮苷元的研究

涂紹勇1，李鳳嬌1，楊愛華2

(1.武漢生物工程學(xué)院生物工程系，湖北 武漢 430415；2.武漢生物工程學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程系，湖北 武漢 430415)

探討微生物轉(zhuǎn)化沙棘黃酮苷生成黃酮苷元的工藝條件。選取1株黑曲霉菌株進行試驗，考察發(fā)酵產(chǎn)物中主要黃酮苷元異鼠李素、槲皮素的含量變化。通過單因素和正交試驗分別研究最佳氮源和轉(zhuǎn)化條件，微生物轉(zhuǎn)化后用HPLC法測定。結(jié)果表明：以黃豆粉為氮源可得到最高的黃酮苷元含量；最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30℃、裝液量體積分數(shù)40%、轉(zhuǎn)速180r/min、發(fā)酵時間96h，在此條件下，轉(zhuǎn)化得到的異鼠李素為78mg/g，槲皮素為22mg/g。

沙棘；黃酮苷；黃酮苷元；黑曲霉；微生物轉(zhuǎn)化

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)，又名酸刺、醋柳，系胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬植物，為落葉灌木，小喬木或喬木，常有枝刺，雌雄異株，主要分布在歐亞兩大陸溫帶地區(qū)。我國是本屬植物分布面積最大，種類最多的國家[1]。沙棘果中含有豐富的黃酮類物質(zhì)[2]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，沙棘黃酮具有抗心肌缺血[3]、抗心率失常[4]、提高免疫功能[5]、抗癌[6]、抗過敏[7]、抗氧化[8]、抑制血小板聚集[9]、抗?jié)?、抗衰老、抗輻射和抗菌、抗病毒[10-11]功能等廣泛的藥理作用。

苷(glycosides)，又稱配糖體，是由糖或糖的衍生物，如氨基酸、糖醛酸等與另一非糖物質(zhì)通過糖的端基碳原子連接而成的化合物，其中非糖部分稱為苷元(aglycone)或配基。苷的藥效由苷元決定的，苷元與糖結(jié)合成苷后，其理化性質(zhì)改變，影響了藥代動力學(xué)過程、藥效強度[12-13]。持續(xù)時間藥物代謝動力學(xué)研究證明，苷類化合物不易被腸道吸收，在人體內(nèi)難以直接發(fā)揮藥效作用，因而導(dǎo)致生物利用度低下，它們必須在腸道內(nèi)被微生物轉(zhuǎn)化成苷元，才能經(jīng)腸道吸收從而發(fā)揮藥物作用[14-15]。

黃酮苷轉(zhuǎn)化為苷元的途徑有化學(xué)法及生物法。化學(xué)法由于在強烈的化學(xué)反應(yīng)中苷類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型會發(fā)生改變，導(dǎo)致其產(chǎn)物不穩(wěn)定或藥效消失；生物轉(zhuǎn)化既可增加目標產(chǎn)物產(chǎn)量，克服化學(xué)合成的缺點，又因其大多數(shù)是在室溫、中性環(huán)境中作用，減少了產(chǎn)物分解、異構(gòu)、消旋和重排反應(yīng)等不利因素，因此，具有位置選擇性和立體選擇性，以及無毒、無污染、低成本、高收率等優(yōu)點，因此，開展有關(guān)這方面的研究具有重要的價值和意義。本研究利用微生物直接進行沙棘黃酮苷轉(zhuǎn)化為黃酮苷元的研究，從而簡化了工藝條件，為相關(guān)的研究工作提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生沙棘果，品種為烏蘭格木，采自內(nèi)蒙古；槲皮素、異鼠李素標準品(批號為110860-200406)由中國藥品生物制品檢定所提供；黑曲霉A166由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；其他試劑均為分析純，均由武漢生物工程學(xué)院酶工程實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂20g，加水定容至1L，pH值自然，121℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：在含有基本碳源和氮源的培養(yǎng)液中添加0.1g/100mL的CaCl2、ZnSO4、K2HPO4、MgSO4· 7H2O，pH6.5～7.0，121℃滅菌20min。

1.3 儀器與設(shè)備

LC-10Avp高效液相色譜儀：配有色譜柱(SHIMADZU VP-ODS (150mm×4.6mm，5μm) 日本島津；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；HQ 45Z恒溫搖床 武漢中科科技技術(shù)發(fā)展有限責任公司。

1.4 方法

1.4.1 產(chǎn)物苷元異鼠李素和槲皮素的高效液相色譜分析

高效液相色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-體積分數(shù)0.4%磷酸溶液(58:42，V/V)為流動相，流速為lmL/min，檢測波長為360nm，理論板數(shù)按異鼠李素峰計算應(yīng)不低于3000。

1.4.2 氮源的選擇

分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2%的氯化銨、大豆粉、酵母膏、豆渣(濕)作為氮源，裝液量體積分數(shù)30%，滅菌前調(diào)pH6.5～7.0，180r/min、30℃搖床發(fā)酵培養(yǎng)5d。加無水乙醇終止反應(yīng)，后將乙醇和水全部蒸干，進行定量分析，測定黃酮苷元含量，以最高苷元含量確定氮源。

1.4.3 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵條件

分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2%的豆渣(濕)作為氮源，調(diào)節(jié)pH6.5～7.0，將菌種以菌絲體形式接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，采用正交試驗法對發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、轉(zhuǎn)速、裝液量4個發(fā)酵條件進行優(yōu)化(表1)。發(fā)酵完成后加無水乙醇終止反應(yīng)，后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將乙醇和水全部蒸干，進行定量分析，通過高效液相色譜檢測發(fā)酵前后沙棘黃酮苷元的主要成分：槲皮素、異鼠李素的含量，以兩者含量之和為考察指標，確定菌種轉(zhuǎn)化沙棘苷的最適條件。

表1 沙棘黃酮苷元發(fā)酵條件的正交試驗因素及水平設(shè)計表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 標準樣品及沙棘果泥發(fā)酵前黃酮苷元高效液相色譜分析

圖1 異鼠李素標準品HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of isorhannetin standard

圖2 槲皮素標準品HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram of quercetin standard

圖3 發(fā)酵前黃酮苷元HPLC圖Fig.3 HPLC chromatogram of flavonoid glycosides in sea-buckthorn fruit before fermentation

由圖1得知，異鼠李素的保留時間為15.215min。由圖2可知，槲皮素的保留時間為7.590min。圖3為發(fā)酵前黃酮苷元色譜圖。由圖1～3可知，每克樣品發(fā)酵前含異鼠李素0.36mg和槲皮素0.28mg。

2.2 不同氮源對發(fā)酵的影響

表2 不同氮源對沙棘黃酮苷元發(fā)酵的影響Table 2 Effect of nitrogen source type on the contents of isorhannetin and quercetin in fermentation broth

從表2可以看出，以黃豆粉為氮源時，異鼠李素和槲皮素的含量最高，分別達到69mg/g和22mg/g，兩者合計91mg/g，因此確定黃豆粉為最佳氮源。圖4為以黃豆粉作為氮源發(fā)酵后高效液相色譜法檢測圖譜。但如果從經(jīng)濟方面考慮，黃豆粉為農(nóng)產(chǎn)品加工品，成本較高，市場價格為4000元/t左右，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；采用豆渣為發(fā)酵氮源，異鼠李素和槲皮素的總含量可以達到85mg/g，而豆渣為豆制品加工過程中的副產(chǎn)物，市場價格為500元/t左右，不僅降低了成本，還能對廢棄物進行回收利用，同時也能保證較高的轉(zhuǎn)化率，是很好的選擇。時間為96h，裝液量體積分數(shù)為40%，溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為180r/min，在此條件下，苷元含量達到100mg/g。圖5為沙棘果泥發(fā)酵因素A2B1C2D3的HPLC圖。

表3 沙棘果泥生成的培養(yǎng)條件正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal array design matrix and experimental results

圖4 黃豆粉為氮源發(fā)酵后HPLC圖Fig.4 HPLC chromatogram of flavonoid glycosides in sea-buckthorn fruit after fermentation with added soybean dregs as nitrogen source

2.3 培養(yǎng)條件的正交試驗結(jié)果

按表1設(shè)計的研究因素及水平進行試驗，研究黑曲霉A166發(fā)酵沙棘果泥的最適培養(yǎng)條件。通過高效液相色譜檢測得知發(fā)酵后每克發(fā)酵產(chǎn)物含異鼠李素、槲皮素的質(zhì)量見表3，最佳試驗條件下產(chǎn)物的HPLC分析見圖5。

從表3可以看出，本研究以異鼠李素和槲皮素的總含量為考察指標，最佳組合為A2B1C1D3，第4試驗組A2B1C2D3，在該條件下總含量達到100mg/g。在實驗范圍內(nèi)，根據(jù)極差分析，各因素影響大小依次為B＞D＞A＞C，即時間起主導(dǎo)作用，裝液量和溫度次之，轉(zhuǎn)速的影響相對較小，所以C因素的選擇對于生成苷元含量的大小并未產(chǎn)生什么影響，且考慮到某些條件的限制等，故C因素選擇第2水平。綜上，黑曲霉A166轉(zhuǎn)化沙棘黃酮苷生成苷元的最佳條件是A2B1C2D3，即發(fā)酵

圖5 沙棘果泥發(fā)酵因素最佳組合條件下的HPLC圖Fig. 5 HPLC chromatogram of fermented sea-buckthorn fruit slurry under optimized conditions

3 結(jié) 論

微生物在發(fā)酵過程中可以分泌多種胞外酶到培養(yǎng)基中，所產(chǎn)生的胞內(nèi)酶數(shù)量更多。這些種類豐富而活性顯著的酶系可將黃酮苷成分分解轉(zhuǎn)化為苷元。其中，柚苷酶表現(xiàn)有促進黃酮苷轉(zhuǎn)化為苷元的生物活性，而黑曲霉具有產(chǎn)柚苷酶的能力，因此，本實驗選擇1株高產(chǎn)柚苷酶的生產(chǎn)菌株黑曲霉A166為發(fā)酵菌株，對沙棘果泥黃酮苷的發(fā)酵過程進行了實驗。首先采用單因素試驗考察了氮源對沙棘果泥中黃酮苷轉(zhuǎn)化為苷元的效果，以確定最適合此菌種發(fā)酵的氮源種類，進而采用正交試驗考察發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、裝液量、轉(zhuǎn)速等發(fā)酵條件對發(fā)酵過程的影響，目的為尋求一種最優(yōu)發(fā)酵條件。

沙棘黃酮的微生物轉(zhuǎn)化國內(nèi)尚未見研究報道，本研究以黑曲霉為出發(fā)菌株，探討微生物轉(zhuǎn)化沙棘黃酮苷成為苷元的發(fā)酵條件，并考察了生物轉(zhuǎn)化后的活性成分的HPLC分析。通過成分的HPLC分析，得出微生物轉(zhuǎn)化黃酮苷成為苷元是非常有效的手段。

通過單因素試驗，確定以大豆粉為氮源的培養(yǎng)基最有利于黃酮苷的轉(zhuǎn)化，異鼠李素和槲皮素的總含量達到91mg/g，但如果從生產(chǎn)成本來考慮，在轉(zhuǎn)化效果相差不大的情況下，筆者認為以豆渣為氮源比較合理(以豆渣為氮源時兩者的總含量為85mg/g)，可能更有利進行工業(yè)化生產(chǎn)。

通過發(fā)酵條件的正交試驗分析，黑曲霉A166轉(zhuǎn)化沙棘黃酮苷生成苷元的最佳條件是：發(fā)酵時間96h、裝液量為體積分數(shù)40%、溫度30℃、轉(zhuǎn)速180r/min，在此條件下，轉(zhuǎn)化得到的異鼠李素為78mg/g，槲皮素為22mg/g，相對于發(fā)酵前的含量(異鼠李素0.36mg和槲皮素0.28mg)大大提高。

黑曲霉菌是國際公認的可用于食品的安全菌株，使用該菌建立的發(fā)酵工藝，安全可靠，可以作為后續(xù)研究和工業(yè)化生產(chǎn)的參考菌株。

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Microbial Conversion of Flavonoid Glycosides in Sea-buckthorn Fruit into Aglycones

TU Shao-yong1，LI Feng-jiao1，YANG Ai-hua2
(1. Department of Bioengineering, Wuhan Bioengineering Institute, Wuhan 430415, China；2. Department of Chemistry and Environment Engineering, Wuhan Bioengineering Institute, Wuhan 430415, China)

This paper reports the optimization of Aspergillus niger fermentation of sea-buckthorn (Hippophae rhamnoides) fruit slurry for the conversion of flavonoid glycosides into aglycones. The effect of nitrogen source type on the contents of isorhannetin and quercetin in fermentation broth was examined and fermentation temperature and duration, shaking speed and volume percentage of medium occupying fermentor were optimized using orthogonal array design for obtaining maximum sum of the contents of isorhannetin and quercetin in fermentation broth. Soybean dregs were the best choice for maximum aglycone content. The optimal levels of fermentation temperature and duration, shaking speed and volume percentage of medium occupying fermentor were 30 ℃, 96 h, 180 r/min and 40%, respectively, and the resultant contents of isorhannetin and quercetin 78 mg/g and 22 mg/g.

Hippophae rhamnoides；flavonoid glycosides；aglycone；Aspergillus niger；microbial conversion

TS201.1；S793.6

A

1002-6630(2010)19-0221-04

2010-01-03

涂紹勇(1979—)，男，講師，碩士，主要從事酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用研究。E-mail：303837684@qq.com