張 帆,王德云,趙曉娜,王君敏,胡元亮

南京農業(yè)大學中獸醫(yī)學研究室,南京 210095

響應面法探討氯磺酸-吡啶法修飾條件對硫酸化當歸多糖取代度的影響

張 帆,王德云,趙曉娜,王君敏,胡元亮＊

南京農業(yè)大學中獸醫(yī)學研究室,南京 210095

用氯磺酸-吡啶法對當歸多糖進行硫酸化修飾。用響應面法研究了修飾條件中反應溫度 (A)、反應時間(B)和氯磺酸-吡啶比例 (C)三個因素對產物的硫酸基取代度的影響,建立回歸模型,驗證了其有效性,并分析了主效應和因素交互作用。結果表明,在A為 65～95℃、B為 60～180 min、C為 1:3～14.3范圍內,三個因素與產物平均取代度 (Y)的回歸模型為 Y=2.74+0.66×A+0.66×B+0.80×C+0.51×A×B-0.31×A×C-0.16 ×B×C-0.34×A2-0.23×B2-0.50×C2;F檢驗證明模型擬合較好,可以用于量化控制反應條件;三個因素對取代度的影響程度為 C＞A=B,A和B之間存在極顯著的交互作用。

響應面法;當歸多糖;氯磺酸-吡啶法

硫酸化多糖或多糖硫酸酯是一類糖羥基上帶有硫酸根的多糖,具有抗病毒、抗腫瘤、抗凝血和增強免疫等生物學活性。研究發(fā)現,一些多糖本來無生物活性或某些生物活性很弱,通過硫酸化修飾以后,能獲得新的生物活性或增強某些生物活性[1]。因此,可以運用硫酸化修飾的方法對其進行結構改造,獲取更多的硫酸化多糖。多糖的硫酸化修飾方法有多種,其中以氯磺酸-吡啶法最為常用。在氯磺酸-吡啶法中,試劑配比、反應溫度和反應時間對修飾的影響較大[2],且硫酸基取代度直接影響硫酸化多糖的生物活性[3]。所以要制備不同取代度的多糖硫酸酯,選用合適的反應條件是關鍵。

響應面法 (Response Surface Methodology)是采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數關系,通過對回歸方程的分析優(yōu)化工藝參數,預測響應值的一種統(tǒng)計方法,能評價在試驗區(qū)間內,各變量對響應值的影響[4]。本研究用響應面法探討了反應溫度、反應時間和氯磺酸-吡啶比例對當歸多糖氯磺酸-吡啶法修飾產物硫酸基取代度的影響,旨在研究 3個因素與產物取代度之間的量化關系,以用于指導制備一定取代度的當歸多糖硫酸酯時控制反應條件。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

BS-100A自動部分收集器 (上海滬西分析儀器廠有限公司);透析袋 (上海綠鳥科技發(fā)展有限公司);冷凍干燥器 (日本島津公司);754單光束紫外-可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司);旋轉蒸發(fā)器RE-52A(上海亞榮生化儀器廠);FA1104N型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。

Sephadex-G200(pharmacia分裝);氯磺酸 (上海實驗試劑有限公司);吡啶 (080305,上海凌峰化學試劑有限公司);硫酸鉀 (20050406,上海振欣試劑廠);N,N-二甲基甲酰胺 (DMF,T20080115,國藥集團化學試劑有限公司)。以上試劑均為分析純。

1.2 當歸多糖的提取和純化

當歸多糖的提取用水煎醇沉法。取當歸飲片 1 kg,粉碎后加 10倍水,先用武火加熱,待沸騰后改用文火加熱 1.5 h,紗布過濾,藥渣復煎 2次,合并 3次煎液,加熱濃縮至含生藥 1 g/mL,2500 r/min離心20 min后抽濾,濾液中加 95%酒精直至最終溶液中酒精含量為 90%,4℃過夜,抽濾收集沉淀,真空干燥,得粗當歸多糖。用 Savage法[5]去蛋白,過 DEAE-纖維素 (OH-型,3.0×50 cm)進行分離,用 500 mL蒸餾水洗脫,流速 1 mL/min,分部收集,每管 4 mL,合并洗脫液,減壓濃縮后過 Sephadex G-200層析柱進一步純化[6],Sephadex G-200柱 (2.0×90 cm)上樣量 15 mL,蒸餾水洗脫,流速每小時 15 mL,分部收集,每管 3 mL,硫酸-苯酚法[7]顯色,在 490 nm下比色檢測峰位,收集主峰,冷凍干燥,得純當歸多糖。用硫酸-苯酚法測定其糖含量為91.7%,考馬斯亮藍[8]法測定其蛋白含量為 0.2%。

1.3 當歸多糖硫酸化修飾響應面試驗設計

選取氯磺酸-吡啶比例、反應溫度和反應條件 3個因素,以所制備的當歸多糖硫酸酯的硫酸基取代度(DS)為響應值,用Box-Behnken設計了三因素三水平試驗。根據文獻,3個因素的水平取值區(qū)間一般在如下范圍:溫度 60～95℃,反應時間 1～3 h,氯磺酸-吡啶比率 1∶3～1∶14.29(比值 0.07～0.33),同時考慮模型設計要求取值須在中心點周圍對稱分布,故所取因素水平中心點為反應溫度 80℃、反應時間 2 h、試劑比值 0.25(1∶4)。中心點和中心點兩側的水平取值分別用代號 0、1和-1表示 (表 1),三因素三水平共 17個試驗(表 2)。

表 1 當歸多糖硫酸化響應面試驗因素及水平表Table 1 Factors and levels of RS M test in sulfated modification of angelica polysaccharide

1.4 當歸多糖硫酸酯化操作

酯化試劑制備[9]:按表 2設定的氯磺酸-吡啶比例,取無水吡啶置于反應瓶中,經冰鹽浴冷卻后,邊攪拌邊逐滴滴加氯磺酸,滴加完畢后按每份含吡啶40 mL分裝。共制備氯磺酸-吡啶比為 0.33(1∶3)的酯化試劑 4份,0.07(1∶14.29)的 4份,0.20(1∶4)的 9份,密封冷藏備用。

酯化操作:精密稱取純化的當歸多糖 50 mg,懸浮于 10 mL DMF中,加入 1份酯化試劑,按所設定條件置水浴搖床反應。反應結束后,加入 4℃蒸餾水 100 mL,用飽和NaOH調 pH至 7.5,加入 3倍體積無水乙醇,4℃靜置過夜,取沉淀自來水透析 2 d,蒸餾水透析 1 d,透析液冷凍干燥,得到當歸多糖硫酸酯。

1.5 硫酸化當歸多糖取代度測定

用氯化鋇-明膠法[10]。取 1 mol/L HCl溶解K2SO4使其濃度為 1.0875 mg/mL,分別吸取該溶液0.02、0.06、0.10、0.14、0.18、0.20 mL,用 1 mol/L HCl補足至 0.2 mL,分別加入三氯乙酸 3.8 mL,氯化鋇-明膠溶液 1 mL和明膠溶液 1 mL,充分混合后室溫靜置 15 min,用分光光度計測定混合液 360 nm處的吸光值,記錄各組氯化鋇-明膠組與明膠組吸光值之差,以硫酸根濃度為橫坐標,差值為縱坐標繪制標準曲線。將樣品溶于 1 mol/L HCl,配成 1 mg/mL的溶液,100℃水浴中水解 4 h。取 2份 0.2 mL水解液,同法測定氯化鋇-明膠組和單一明膠組的吸光值,計算兩組之差。將測樣差值代入標準曲線,得樣溶液中硫酸基濃度 S%,S1%除以樣品濃度 (1 mg/ mL)得固體樣品中硫酸基的質量分數 S%。按下式計算取代度DS=(1.62×S%)/(32-1.02×S%)。

1.6 回歸模型的建立

以 17次試驗反應條件編碼值 (A、B、C)為自變量,以產物的DS為響應值 (Y),用 SAS軟件擬合多元回歸模型:Y=k0+k1×A+k2×B+k3×C+k4× A×B+k5×A×C+k6×B×C+k7×A2+k8×B2+ k9×C2,求最佳 k0～k9值,生成回歸方程。

1.7 回歸模型的有效性分析

對回歸方程進行方差分析,將總方差變異來源拆分為回歸模型、失擬指數 (lack of fit value)和純誤差 3項。如果回歸模型未達到顯著水平 (P＞0.5),表示該模型不適合用來解釋和預測此試驗;如果失擬指數達到顯著水平(P＜0.5),表示各試驗點實際值偏離理論值過大,擬合效果較差。

1.8 主效應分析

將方差分析結果中模型變異來源拆分成各因素及其交互項,根據 F值判定其對響應值的影響是否顯著,及影響程度大小。

1.9 因素交互影響分析

分別將 3個因素中的 1個因素編碼值取 0,得到其他 2個因素對響應值影響的方程,作相應的三維曲面圖和等高線圖分析這種影響的變化趨勢,并進一步分析達到顯著水平的交互效應。

1.10 回歸模型的有效性驗證

將A、B、C分別取值為-1、-1、1,在此條件下重復 3次試驗,試驗結果用 t檢驗判定是否與理論值相符。

2 結果與討論

2.1 響應面試驗響應值

17次試驗結果見表 2。

表 2 當歸多糖硫酸化修飾響應面試驗設計及響應值Table 2 Dsign and response values of RS M test in sulfated modification of angelica polysaccharide

7 2.4277 8 0 0 0 2.4914 9 0 0 0 2.5591 10 1 -1 0 1.5359 11 0 1 1 3.2159 12 0 0 0 3.0172 13 1 1 0 4.0753 14 0 -1 -1 0.4746 15 -1 0 1 2.3148 16 -1 0 -1 0.1230 17 -1 -1 0 1.2812 0 0 0

2.2 回歸模型

硫酸基平均取代度 (Y)與反應溫度 (A)、反應時間(B)、酯化試劑比例 (C)三因素編碼空間的多元回歸模型為 Y=2.74+0.66×A+0.66×B+ 0.80×C+0.51×A×B-0.31×A×C-0.16×B×C -0.34×A2-0.23×B2-0.50×C2。

2.3 回歸模型的有效性

回歸模型的方差分析結果見表 3。

表 3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表 3可見,失擬指數P值為 0.8832,遠大于0.05,表明回歸方程無失擬因素存在,回歸式擬合得較好。回歸方程顯著性檢驗 P值小于 0.01,表明回歸方程達到極顯著,在試驗范圍內可以用來解釋和預測試驗結果。

2.4 回歸模型的主效應

回歸模型的參數估計值見表 4。

表 4 回歸模型參數估計值Table 4 Parameter estimate value of regression model

模型Model 9 15.5376 1.7264 20.868 0.0003＊＊A 1 3.4586 3.4586 41.8065 0.0003＊＊B 1 3.4780 3.4780 42.0408 0.0003＊＊C 1 5.0664 5.0664 61.2407 0.0001＊＊AB 1 1.0526 1.0526 12.7234 0.0091＊＊AC 1 0.3917 0.3917 4.7352 0.0660 BC 1 0.1020 0.10197 1.2325 0.3036 A21 0.5000 0.5000 6.0434 0.0436＊B21 0.2291 0.2291 2.7694 0.1400 C21 1.0734 1.0734 12.9750 0.0087＊＊

由表 4可見,模型中 A、B、C、AB、C2的 P值分別為 0.0003,0.0003,0.0001,0.0091,0.0087,均小于 0.01,表明它們對當歸多糖硫酸化產物平均取代度有極顯著的影響。而 AC、BC、A2、B2的 P值均大于 0.05,表明其對取代度影響不顯著 (P＞0.05)。同時,根據 F值大小可推知,試劑比例對當歸多糖硫酸酯硫酸取代度的影響最大,反應時間和反應溫度對其影響幾乎相同。即試劑比例 ＞反應時間 =反應溫度。

2.5 因素的交互影響

2.5.1 反應溫度和反應時間對取代度的影響

反應時間A和反應時間B對產物取代度 Y的影響的回歸方程為 Y=2.74+0.66×A+0.66×B +0.51×A×B-0.34×A2-0.23×B2,相應的三維曲面圖和等高線圖見圖 1。圖的曲面呈斜向上坡形,表明在試驗范圍內,隨著反應溫度的上升和反應時間的延長,產物取代度增高。等高線呈外密內疏,表明在較低反應溫度,提高溫度對取代度的影響比較高溫度時大。反應時間對取代度的影響也是同樣。

圖 1 反應溫度和反應時間對產物取代度的影響Fig.1 Effects of reaction temperature and time on DS of product

表 4中 PAB=0.091,P＜0.01,表明反應溫度A與反應時間B的交互作用極顯著。在 A編碼取-1、0、1時,Y隨B的變化曲線如圖 2。在試驗范圍內,三條曲線均斜向上,表明在各個溫度下,產物取代度隨時間延長而升高;溫度較高時的曲線位置比溫度較低時高,表明溫度越高,相同反應時間時產物取代度越高;溫度較高的曲線的斜率比溫度較低時大,表明隨溫度上升,產物取代度對反應時間的敏感性越高,即溫度越高,延長相同反應時間,產物取代度的上升量越高。

值得注意的是,95℃線與 80℃線在反應時間接近 1.5 h時有交點,而從 95℃線和 65℃線的趨勢來看,它們很有可能在反應時間為 1 h以內的某個位置也有交點。這表明在反應時間較短的情況下,較低的反應溫度得到的產物的取代度可能會比較高溫度時高,這極有可能是因為反應機理的不同而引起的。也就是說,較高溫度可能會使反應機理發(fā)生變化,這很有可能會導致產物結構的差異。

圖 2 65,80,95℃時反應時間對產物取代度的影響Fig.2 Effects of reaction time on DS of product at 65,80 and 95℃

2.5.2 反應溫度和試劑比例對取代度的影響

反應溫度A和試劑比例 C對產物取代度 Y的影響的方程為 Y=2.74+0.66×A+0.80×C-0.31×A×C-0.34×A2-0.50×C2,相應的三維曲面圖和等高線圖見圖 3。

圖 3 反應溫度和氯磺酸-吡啶比例對產物取代度的影響Fig.3 Effects of reaction temperature and ratio of chlorosulfonic acid to pyridine on DS of product

圖的曲面呈陡坡向上,逐漸平緩后略有下降,表明起初取代度 Y隨著反應溫度 A和試劑比例 C的上升而升高,升高幅度逐漸減小;當到達某一點時,反應溫度 A和試劑比例 C再升高時,Y即開始下降。即反應溫度 A和試劑比例 C在過低或過高的情況下,Y均不能達到有效最高值。根據 Y對A、C的方程運算可知,當A取值在 0.6即反應溫度為 89℃,C取值為 0.6即試劑比值為 0.298(1∶3.36)時, Y得到最大值。A、C的交互作用未達到顯著(PAC＞0.05)。

2.5.3 反應時間和試劑比例對取代度的影響

反應時間B與試劑比例 C對產物取代度 Y的影響的方程為 Y=2.74+0.66×B+0.80×C-0.16×B×C-0.23×B2-0.50×C2,相應的三維曲面圖和等高線圖見圖 4。

圖 4 反應時間和氯磺酸-吡啶比例對產物取代度的影響Fig.4 Effects of reaction time and ratio of chlorosulfonic acid to pyridine on DS of product

圖的曲面呈陡坡向上,逐漸平緩后略有下降,結合等高線圖,最高點落在 C取值范圍內而在 B取值范圍外。這表明在試驗范圍內,Y隨著 B的增加而升高,但升高的幅度減緩;隨著 C的提高,取代度 Y呈現先上升后下降的變化。根據 Y對B、C的方程運算,可知在 B取值為 1即反應時間為 3 h,C取值為 0.6即試劑比值為 0.298(1∶3.36)時,Y得到最大值。C對 Y的影響體現的是反應物對反應產物的影響。一般來說,提高反應物濃度,有利于反應向正反應方向進行,在氯磺酸-吡啶比例 C比較低時屬于這種情況。當試劑比例逐漸提高,當大于 0.298時,產物取代度反而隨試劑比例上升而下降,這表明有不利于反應的因素產生。這有可能是在酯化試劑的制備過程中,高氯磺酸比例造成的產物板結[11,12],致使制備的酯化試劑的有效成分比低氯磺酸比例時反而低,也有可能是高比例的氯磺酸使反應體系 pH過低,反而使取代反應平衡向相反方向移動[13],這還需進一步試驗驗證。B、C的交互作用未達到顯著

(PBC＞0.05)。

2.6 回歸模型的有效性驗證

A、B、C分別取值為-1、-1、1時,回歸模型預測的DS值為 2.13。3次重復試驗的DS均值為 2.103 ±0.07,|t|=0.4158＜t0.05,2,P＞0.05,這表明實際值與理論預測值差異不顯著,說明該模型的預測條件與實際情況較符合。

本試驗通過Box-Behnken設計建立了當歸多糖硫酸酯的平均取代度與反應溫度、反應時間、酯化試劑氯磺酸-吡啶比例的三因素的回歸模型,該模型擬合較好,可以用于量化控制反應條件。三個因素對當歸多糖硫酸酯取代度的影響為試劑比例 ＞反應溫度 =反應時間,反應溫度和反應時間之間存在極顯著的交互作用。

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Effects ofM odification Conditions on Degree of Substitution of Sulfated Angelica Polysaccharide by Response SurfaceM ethedology

ZHANG Fan,WANG De-yun,ZHAO Xiao-na,WANG Jun-min,HU Yuan-liang＊
Institute of Traditional Chinese Veterinary M edicine,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China

Angelica polysaccharide wasmodified by chlorosulfonic acid-pyridine method.The influences of reaction temperature(A),reaction t ime(B)and the ratio of chlorosulfonic acid to pyridine(C)on the degree of substitution(DS) of productionwere studied by response surfacemethodology(RS M).Recursive modelwas established,the validity of the modelwas tested and the main effect and interaction of the factors were analysed.The results indicated that within the range ofA being 65-95℃,B being 60-180 min and C being 1:3-1:14.3,the regressionmodel between three factors and average DS(Y)was Y=2.74+0.66×A+0.66×B+0.80×C+0.51×A×B-0.31×A×C-0.16×B×C-0.34×A2-0.23×B2-0.50×C2.The F test proved that the model possessed well fit and could be used to control the reaction conditions.The influencing degree of three factorsonDSwasC＞A=B.Therewas extremely significant interaction between A and B.

response surface methodology;angelica polysaccharides;chlorosulfonic acid-pyridine method

Q946.91;R284.1;S853.72

A

1001-6880(2010)05-0830-06

2008-12-16 接受日期:2009-02-26

國家自然科學基金項目 (30871887,30571360);南京農業(yè)大學青年科學基金項目(KJ07015)

＊通訊作者 Tel:86-25-84395203;E-mail:ylhu@njau.edu.cn.