林 筱,魯春華,黃耀堅(jiān),沈月毛

廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院藥物微生物工程實(shí)驗(yàn)室,廈門(mén) 361005

番荔枝內(nèi)生真菌Hypoxylonsp.B38的代謝產(chǎn)物研究

林 筱,魯春華,黃耀堅(jiān)＊,沈月毛

廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院藥物微生物工程實(shí)驗(yàn)室,廈門(mén) 361005

從番荔枝內(nèi)生真菌Hypoxylonsp.B38的固體平板發(fā)酵提取物中分離到 5個(gè)化合物,通過(guò)NMR和MS等方法把它們分別被鑒定為L(zhǎng)achnellin D(1)、Dienetriol 9(2)、Lachnellin C(3)、Lachnellin B(4)和Benzo[d][1, 3]dioxol-5-ylmethanol(5)。

番荔枝;Hypoxylonsp.B38;NMR;lachnellin

植物內(nèi)生真菌是尋找生物活性天然產(chǎn)物的豐富資源,目前已報(bào)道從內(nèi)生真菌中得到的次生代謝產(chǎn)物包括抗生素、抗腫瘤化合物、抗氧化化合物等[1,2]。我們研究的內(nèi)生真菌來(lái)自番荔枝科 (Annona)的番荔枝 (Annona squam osaL.)。從該植物中分離的番荔枝內(nèi)酯類(lèi)化合物多達(dá) 100多種,且?guī)缀醵季哂锌鼓[瘤活性,番荔枝科植物的抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)已成為熱點(diǎn)。對(duì)番荔枝內(nèi)生真菌進(jìn)行研究,不僅可以考察番荔枝內(nèi)生真菌的種群多樣性,同時(shí)番荔枝內(nèi)生真菌是重要的微生物資源,對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究可以發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的化合物;本文介紹從其內(nèi)生真菌Hypoxylonsp.B38分離到的 5個(gè)已知化合物。

1 材料與方法

1.1 儀器材料

反相硅膠 RP-18(Merck);凝膠 Sephadex LH-20 (Phammacia);柱層析用硅膠 (200～300目)和硅膠GF254薄層層析板 (青島海洋化工廠);Bruke ARX600核磁共振儀;Micro Mass-Q TOF質(zhì)譜儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株和發(fā)酵培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)菌株從采自中國(guó)福建省廈門(mén)地區(qū)的番荔枝植物葉片組織中分離純化得到。B38通過(guò) ITS序列分子鑒定,確定為Hypoxylonsp.,其 ITS r DNA序列信息已經(jīng)公布(EF488415)。

馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基 (PDA):馬鈴薯去皮,200 g切成小塊,加水煮沸 30 min,4～6層紗布過(guò)濾,加 20 g葡萄糖,加入 1.5%～2%的瓊脂,加水定容至 1000 mL。121℃高壓滅菌 20 min。

1.3 方法

1.3.1 菌株Hypoxylonsp.B38的發(fā)酵

從 PDA培養(yǎng)基斜面上挑取Hypoxylonsp.B38菌體接種至 PDA平板,28℃培養(yǎng) 3～4 d后挑取菌體,接種至 4 L PDA培養(yǎng)基平板中,28℃培養(yǎng) 14 d。

1.3.2 成分的提取分離

培養(yǎng)物切割成小塊狀后用乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸 (80∶15∶5)的混合溶液提取,共 3次;合并 3次提取液后,40℃減壓濃縮至干,用甲醇溶解過(guò)濾得發(fā)酵提取浸膏。浸膏用水溶解,用乙酸乙酯萃取至無(wú)色,40℃減壓濃縮至干,得到乙酸乙酯可溶部分8.0 g。

乙酸乙酯可溶部分 8.0 g經(jīng)反相中壓液相柱層析(RP-18,180 g),依次用 30%、50%、70%、100%甲醇水系統(tǒng)洗脫,每個(gè)梯度 2 L,流速為 20 mL/min,每 200 mL收集一管,分別濃縮至干。少量甲醇溶解后,根據(jù) TLC檢測(cè)結(jié)果合并,得 A(1.0 g)、B(2.5 g)、C(1.6 g)、D(1.6 g)、E(1.4 g)五個(gè)組分。

A(1.0 g)用經(jīng)凝膠柱 (Sephadex LH-20,140 g)層析分離,甲醇洗脫,經(jīng) TLC檢測(cè),合并得 A-1 (800 mg)、A-2(80 mg)、A-3(40 mg)。A-1(800 mg),經(jīng)反復(fù)的中壓反相柱層析,30%甲醇洗脫,得到A-1A 28 mg,A-1B 40 mg,A-1C 120 mg。A-1A經(jīng)反相中壓液相柱層析,25%甲醇洗脫,TLC檢測(cè)合并8-11得化合物 2(2 mg)。A-1B用正相柱層析分離,0.5 g硅膠石油醚飽和裝柱,石油醚∶丙酮 (100∶1,80∶1)洗脫,約 5 mL/tube接收,合并 80∶1洗脫出的 42～70管,經(jīng)薄層層析 (氯仿∶甲醇 =10∶1),硫酸烘烤后,在Rf值約 0.6左右處有紫紅色轉(zhuǎn)棕紅色的單點(diǎn),記為化合物 1(14 mg)。A-1C用 2 g硅膠柱層析分離,石油醚飽和裝柱,石油醚∶丙酮 (500∶1,250∶1)洗脫,約 6 mL/tube接收,合并 500∶1洗脫的 55～61管,經(jīng)薄層層析 (石油醚∶丙酮 =5∶1),硫酸烘烤后,在Rf值約 0.5左右處有紫紅色轉(zhuǎn)棕黃色的單點(diǎn),記為化合物 3(12 mg);合并 250∶1洗脫的 104～133管,經(jīng)薄層層析 (石油醚∶丙酮 =2∶1),硫酸烘烤后,在Rf值約 0.5左右處有紫紅色轉(zhuǎn)棕黃色的單點(diǎn),記為化合物 4(13 mg)。

A-3組分 (40 mg)稱取 0.08 g普通硅膠拌樣, 0.8 g硅膠,石油醚裝柱,石油醚∶丙酮 (200∶1,100∶1)洗脫,約 6 mL/tube接收,合并 100∶1洗脫的 17～26管,經(jīng)薄層層析 (石油醚∶丙酮 =2∶1),硫酸烘烤后,在Rf值約 0.4左右處有紫黑色的單點(diǎn),記為化合物 5(3 mg)。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

通過(guò)中壓反相,正相以及凝膠柱層析,共分離到5個(gè)化合物,根據(jù)NMR以及MS數(shù)據(jù)鑒定了化合物1～5(圖 1),它們分別為L(zhǎng)achnellin D(1),Dienetriol 9(2),Lachnellin C (3),Lachnellin B (4)和Benzo[d]1,3]dioxol-5-y lmethanol(5)。

圖 1 化合物 1～5的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of compounds 1-5

2.6 化合物 1～5的生物活性

采用MTT法[5]測(cè)定化合物 1～5的抗腫瘤活性,指示細(xì)胞株為 Hep G2和 HeLa,化合物 1～5在測(cè)定濃度為 10μg/mL時(shí)沒(méi)有顯示出對(duì)腫瘤細(xì)胞株Hep G2和 HeLa的活性;采用濾紙片法[6]測(cè)定化合物 1～5對(duì)指示菌Bacillus subtilisCMCC63501,EscherichiacoliCMCC44103,StaphylococcusaureusATCC9763,Candida albicansAS2.538的活性,結(jié)果顯示,在每片濾紙片含有 50μg樣品時(shí)也沒(méi)有顯示出對(duì)指示菌株的抑制活性。

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5 Solis PN,W right CW,AndersonMM,et al.A microwell cytotoxicity assay usingA rtem ia salina(Brine Shrimp).Planta M ed,1993,59:250-252.

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Five Compounds fromHypoxylonsp.B38, an Endophytic Fungal Stra in ofAnnona squam osaL.

L IN Xiao,LU Chun-hua,HUANG Yao-jian＊,SHEN Yue-mao
Fujian Engineering Laboratory of Phar maceuticals,School of Life Sciences, Xiam en University,Xiam en 361005,China

Five compounds were isolated from the extract of fermentation broth of endophytic fungus(Hypoxylonsp. B38)ofAnnona squam osaL.On the basis ofNMR andMS data,compounds 1-5 were identified as lachnellinD(1),dienetriol 9(2),lachnellin C(3),lachnellin B(4)and benzo[d][1,3]dioxol-5-ylmethanol(5).

Hypoxylonsp.B38;NMR;lachnellin

R915;Q939.9

A

1001-6880(2010)05-0791-03

2008-12-09 接受日期:2009-02-12

教育部重大項(xiàng)目 (306010)

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