管福琴,馮 煦,彭 峰,單 宇,王 鳴,趙興增

江蘇省中國科學(xué)院植物研究所 (南京中山植物園)江蘇省藥用植物研究開發(fā)中心,南京 210014

灰氈毛忍冬次皂苷乙抑制白血病細胞HL-60的增殖及其機制研究

管福琴,馮 煦＊,彭 峰,單 宇,王 鳴,趙興增

江蘇省中國科學(xué)院植物研究所 (南京中山植物園)江蘇省藥用植物研究開發(fā)中心,南京 210014

研究了灰氈毛忍冬次皂苷乙(MB)在體外對白血病細胞 HL-60和結(jié)腸癌細胞 LOVO增殖的抑制作用,并初步探討其分子機制。采用MTT法檢測MB的增殖抑制作用;利用 RT2ProfilerTMPCR Array芯片實時定量PCR擴增腫瘤發(fā)生中 84個關(guān)鍵基因。結(jié)果表明MB對兩種腫瘤細胞生長均有抑制作用,且對 HL-60效果更好。以 HL-60作為細胞模型,總共發(fā)現(xiàn)差異基因 20個,其中上調(diào)基因 14個,下調(diào)基因 6個,主要作用是阻滯細胞周期和降低細胞侵襲轉(zhuǎn)移。

灰氈毛忍冬次皂苷乙;MTT;基因芯片;細胞周期;侵襲轉(zhuǎn)移;HL-60

灰氈毛忍冬Lonicera m acranthoidesHand.Mazz.為忍冬科忍冬屬植物,具有清熱解毒、抗菌消炎的功效,在臨床上廣泛用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫?zé)岚l(fā)病等疾病的治療。中華人民共和國 2005版藥典將其作為新增品種收載,與紅腺忍冬、華南忍冬一同列入山銀花項下。雖然其在西南地區(qū)被廣泛的應(yīng)用,但針對它的有效成分和藥理作用研究報道零星可見[1-7]。近年來,本課題組利用現(xiàn)代色譜分離技術(shù),以藥理作用研究為指導(dǎo),對灰氈毛忍冬化學(xué)成分進行系統(tǒng)研究,從灰氈毛忍冬干燥花蕾的乙醇提取物中分離得到三萜皂苷類成分 19個[8-10],其中包括灰氈毛忍冬次皂苷乙 (MB)。韓國的 Ahn教授曾經(jīng)報道,從白頭翁花Pulsatilla koreanaN.分離出的次皂苷乙,體內(nèi)體外有一定的抗腫瘤活性,對 Lewis肺癌的抑瘤率達到 50.3%[11]。因此,本課題組在驗證了次皂苷乙有一定的抗腫瘤活性的報道的基礎(chǔ)上[12],又首次研究其對非實體瘤的作用;同時從分子水平上,應(yīng)用人腫瘤信號通路發(fā)現(xiàn)者芯片對次皂苷乙作用前后非實體瘤細胞 HL-60的基因表達差異進行檢測,并對差異基因進行功能分類,研究次皂苷乙的抗腫瘤作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

灰氈毛忍冬次皂苷乙 (純度大于 99%)本實驗室生產(chǎn)[8];HL-60細胞購自中科院上海細胞庫; IMDM培養(yǎng)基,購自 G IBCO公司;小牛血清和青霉素、鏈霉素,購自南京生興公司;焦炭酸二乙酯 (diethyl pyrocarbonate,DEPC)購自 Sigma公司,TR IZOL試劑購自 Invitrogen公司;RNeasy?MinEluteTM純化試劑盒購自 Qiagen公司;RT2ProfilerTMPCR Array芯片、Supe rArray PCR混合液、以及 RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國 SuperArray公司。RT2ProfilerTMPCR Array芯片是專為熒光定量 PCR設(shè)計的 96孔微流卡,每孔中預(yù)置了 Super Array基因表達試劑,即經(jīng)過優(yōu)化設(shè)計的用以擴增目的 cDNA片段的上、下游引物和相關(guān)的熒光標(biāo)記探針。腫瘤信號通路發(fā)現(xiàn)者 RT2ProfilerTMPCR Array可以同時測定 84個與轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的代表性的六個信號通路有關(guān)的關(guān)鍵基因。6孔和 96孔細胞培養(yǎng)板 (Greiner);酶標(biāo)儀(Tecan);實時定量 PCR儀 (Applied Biosystems)。

1.2 細胞培養(yǎng)

HL-60和LOVO細胞分別常規(guī)培養(yǎng)(37℃,5% CO2)于含 10%的小牛血清和青霉素、鏈霉素各 100 U/mL的 IMDM和DMEM培養(yǎng)基中。LOVO細胞每48 h用胰蛋白酶消化傳代。

1.3 MTT法檢測MB作用后細胞存活率

取對數(shù)生長期 HL-60和 LOVO細胞接種到 96孔板中。用不同濃度的灰氈毛忍冬次皂苷乙 (0～20μM)處理 48 h后進行檢測。通過酶標(biāo)儀測吸光度值(A),測量波長 570 nm,參考波長 690 nm,并計算細胞存活率。

1.4 基因芯片分析差異表達基因

1.4.1 細胞總 RNA提取和純化

取對數(shù)生長期 HL-60細胞以 2×105/mL的濃度接種 6孔板,加人灰氈毛忍冬次皂苷乙MB,使其最終濃度為 10μM(處理組),對照組是正常培養(yǎng)的HL-60細胞。48 h后離心棄掉培養(yǎng)液上清,以磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌 2次。每個樣品加入 1 mL TRIZOL試劑完全裂解細胞,氯仿抽提,異丙醇沉淀回收總 RNA,貯存于-70℃。取 Dnase I處理后 RNA,用 RNeasy?MinElute純化試劑盒純化回收 RNA,去除RNA中可能存在的DNA污染。以 1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計 A260nm/A280nm鑒定 RNA純度和濃度。RNA提取和純化過程使用的移液器頭,EP管和去離子水均經(jīng) 0.1%DEPC處理,容器經(jīng)高溫干烤,以防止 RNase的污染。

1.4.2 熒光定量 RT-PCR

取 1.5μg純化后總RNA,按試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈 cDNA模板,存于-20℃?zhèn)溆?。按?RT2ProfilerTMPCR Array說明,在 96孔板中加入 PCR所需各種試劑,置于實時定量 PCR儀 AB I PR IS M7700 system進行 PCR反應(yīng)。95℃10 min,激活DNA聚合酶;隨后按以下參數(shù)進行 PCR擴增:95℃15 s、60℃1 min,40個循環(huán)。PCR完成后,在AB I PrismSDS 2.1軟件上,經(jīng)自動分析,查看每個基因的擴增情況,導(dǎo)出相應(yīng)的域值循環(huán)數(shù) (cycle at threshold),即Ct值。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析

以看家基因 (HK基因)B2M、HGPRT/HPRT、RPL13A為陽性內(nèi)對照基因,校正 cDNA模板的細胞拷貝數(shù),計算相對量采用 2-ΔΔCt方法。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

各組實驗平行進行,每組實驗至少重復(fù) 3次。所有數(shù)據(jù)均以 x ±s表示,采用 t檢驗進行顯著性分析,＊P＜0.05有顯著差異;＊＊P＜0.01有極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 細胞存活率測定

圖 1 MB作用 HL-60和LOVO細胞 48 h后細胞的存活率。數(shù)值表示為平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差。與對照組比較＊P＜0.05,＊＊P＜0.01。Fig.1 The effects ofMB on the viability of HL-60 and LOVO.Cells were treated with MB for 48 h.Each data value representsmeans±SD(n=3).＊P＜0.05 vs. control;＊＊P＜0.01 vs.control.

根據(jù)MTT法測定不同濃度MB處理 48 h后對HL-60和 LOVO細胞存活率的影響,發(fā)現(xiàn)隨著MB濃度的增加,兩種細胞存活率均明顯降低,當(dāng)濃度大于20μM時,細胞幾乎完全死亡。而且MB對 HL-60的細胞增殖抑制作用更明顯(圖 1)。

2.2 基因芯片檢測結(jié)果

2.2.1 RNA質(zhì)量控制結(jié)果

使用NanoDrop?ND-1000生物分析儀鑒定兩份樣品的 RNA質(zhì)量。分別測定 28s/18s峰值的面積比值、A260/A280的 Ratio值、質(zhì)量濃度,鑒定結(jié)果顯示樣品 RNA均無明顯降解,基本符合基因芯片測定的要求。見圖 2。

2.2.2 芯片雜交質(zhì)控結(jié)果

基因組DNA控制顯示無基因組DNA污染,逆轉(zhuǎn)錄控制和陽性 PCR控制顯示 RNA純度很高,完全能滿足實時定量 PCR要求。

2.2.3 芯片雜交結(jié)果

以 2-ΔΔCt(加藥組)/2-ΔΔCt(對照組)值作為評價標(biāo)準(zhǔn),若大于 2,則基因表達水平上調(diào);若小于-2,則下調(diào)。結(jié)果顯示,3個看家基因在灰氈毛忍冬次皂苷乙MB作用后表達水平無明顯變化;在檢測的 84個基因中,共篩選出差異表達基因 20個,14個上調(diào),6個下調(diào) (表 1,表 2)。

圖2 10μM MB處理HL-60細胞 48 h后樣品 RNA的電泳結(jié)果圖。Fig.2 The agarose gel electrophoresis of RNA for HL-60 cells treated with 10μM MB for 48 h.

表1 MB處理后表達上調(diào)的基因Table 1 Upregulated genes afterMB treatment.

Adhesion ITGB5 3.44 MCAM 2.38 Angiogenesis IGF1 3.28 I L8 2.57 TEK 5.59 Invasion and metastasis NME4 12.94 SERP INE1 4.61 T IMP1 2.16

3 討論

三萜皂苷在自然界分布很廣泛,現(xiàn)代研究表明不同植物來源的多種三萜皂苷具有抗腫瘤活性,如人參、柴胡、合歡、大豆等。灰氈毛忍冬次皂苷乙,一種三萜皂苷,是本課題組從灰氈毛忍冬花蕾中分離得到,前期實驗證實其對多種實體腫瘤細胞有增殖抑制作用[11]。本實驗結(jié)果表明,MB體外不僅能抑制實體腫瘤細胞 LOVO生長,而且對非實體瘤細胞HL-60效果更好。為了進一步研究其分子機制,我們以 HL-60作為細胞模型。

不受控制的細胞增殖是惡性腫瘤的最重要特征。多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均與細胞周期調(diào)控功能紊亂有關(guān),所以,調(diào)節(jié)或阻斷細胞周期是治療腫瘤的途徑之一。Hsu等[13]在肝癌細胞系 Hep G2中發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷 d誘導(dǎo) p53表達、進而上調(diào) p21/ WAF1,導(dǎo)致 G1期阻滯。Mujoo等[14]以合歡皮中三萜皂苷類組分 F035處理人乳腺癌細胞系MDA-MB-453發(fā)現(xiàn)有 G1期阻滯。本實驗結(jié)果表明,AT M(毛細血管擴張性共濟失調(diào)癥突變蛋白)、CCNE1(細胞周期素 E1)基因表達上調(diào),CDC25A(細胞周期調(diào)控因子 25A)、CDK2(細胞周期依賴性蛋白激酶 2)表達下調(diào)。AT M屬于 PIKK(磷脂酰肌醇-3-激酶樣激酶)家族,是DNA損傷檢查點的主要成員。它們被DNA損傷所激活,通過磷酸化相應(yīng)的下游蛋白 CHKl(檢驗點激酶 1)和 CHK2等,調(diào)節(jié)細胞周期各個檢查點,引起細胞周期阻滯,使DNA損傷得以修復(fù)。CDC25A,是 Cdc25磷酸酶的一種亞型,對于有效地促進細胞進入 S期是必需的,在細胞周期的后期也具有作用。研究表明,CDC25A在多種癌癥中過表達[15],如肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等。因此,CDC25A的下調(diào)可控制癌細胞的增殖。CDK2,定位于人 12q13,編碼 33 kD的蛋白質(zhì),為蘇氨酸激酶;CCNE1定位于人 19q12-13,編碼 50 kD的蛋白質(zhì),含一個與 CDKs相互作用的細胞周期素盒。CCNE與 CDK2結(jié)合并使之激活,形成的復(fù)合物可促進視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白 pRB的磷酸化,釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F,促進細胞周期 G1/S期進程。CCNE/CDK2復(fù)合物的活性受多種因素調(diào)節(jié),如 CDC25A表達下調(diào)可抑制 CCNE/CDK2的活性[16-18],阻滯 G1/S期。本研究中,灰氈毛忍冬次皂苷乙作用 HL-60細胞,可能導(dǎo)致 DNA損傷,激活 AT M和 CCNE1、降解CDC25A和 CDK2,從而阻滯細胞于 G1/S期?？梢?灰氈毛忍冬次皂苷乙和其類似的三萜皂苷類物質(zhì)(如柴胡皂苷 d,合歡皮中三萜皂苷類組分 F035)引起的細胞周期改變是一致的。

惡性腫瘤治療的最大障礙就是局部侵襲和遠處轉(zhuǎn)移,抑制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移是抗腫瘤治療的一種重要思路。分析基因芯片篩選得到的差異表達基因,我們發(fā)現(xiàn) T IMP1(組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子)上調(diào),PLAUR(尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑的受體)下調(diào)。T IMP1作為MMPs(基質(zhì)金屬蛋白酶)的抑制因子,其表達上調(diào)可以促進細胞外基質(zhì)(ECM)、尤其是腫瘤周圍纖維結(jié)締組織的合成,使腫瘤周圍包膜形成,最終局限了腫瘤的生長、侵襲與轉(zhuǎn)移;其次,實驗表明 T IMPl能減少血管的形成,作用一種抑制血管生成的因子,可有效抑制腫瘤血管的形成,導(dǎo)致腫瘤細胞壞死,抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[19]。PLAUR,又稱 uPAR,是 uPA(尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑)介導(dǎo)的激活反應(yīng)的關(guān)鍵,uPA只有與細胞膜表面的 uPAR特異性的結(jié)合才能激活纖溶酶,降解腫瘤細胞外基質(zhì)。灰氈毛忍冬次皂苷乙上調(diào)T IMP1表達和下調(diào) PLAUR表達,從而降低細胞的侵襲能力和遠端轉(zhuǎn)移能力。

與傳統(tǒng)的研究方法相比,通過大規(guī)模、高通量的基因芯片技術(shù)研究MB對白血病細胞系 HL-60基因表達譜的影響,能同時研究大量基因的表達變化,在研究復(fù)雜生命活動時具有巨大的優(yōu)勢。但生命活動的執(zhí)行者是蛋白質(zhì)而非mRNA,基因芯片的結(jié)果只能代表轉(zhuǎn)錄水平的變化,因此具有一定的局限性。本研究發(fā)現(xiàn)MB作用 HL-60細胞引起了一些非常重要的信號通路的分子改變,如細胞周期進展中的AT M、CCNE1、CDC25A、CDK2,侵襲轉(zhuǎn)移通路上的T IMP1和 PLAUR。因此推測灰氈毛忍冬次皂苷乙可能通過參與調(diào)節(jié)這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮其抑瘤作用,但其具體機制還需進一步研究。

總之,通過本實驗,我們發(fā)現(xiàn)灰氈毛忍冬次皂苷乙體外能降低 HL-60細胞的存活率,且通過 PCR芯片確定了 10μM處理后表達改變的基因,為進一步研究灰氈毛忍冬次皂苷乙抗腫瘤作用和分子機制提供了方向。

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Antiproliferative Effect ofMacranthoside B on Leukem ia cell lines HL-60 and ItsM echanism

GUAN Fu-qin,FENG Xu＊,PENG Feng,SHAN Yu,WANGMing,ZHAO Xing-zeng
Institute of Botany,Jiangsu Province and Chinese Academ y of Sciences(Nanjing Botanical Garden,M em. Sun Yat-Sen),Jiangsu Center for Research&Developm ent of M edicinal Plants,Nanjing 210014,China

The cytotoxic effects and the molecularmechanism ofMacranthoside B(MB)were investigated in this study. The cytotoxic effects ofMB forLOVO and HL-60 cellswere detected byMTT assay.Using RT2ProfilerTMPCR Array,84 cancer-related geneswere evaluated by a high-throughput quantitative real-time RT-PCR with orwithoutMB treatment. Cell viability assay showed thatMB inhibited cell growth of two cancer cell lines,especially in human acute promyelocytic leukemia HL-60 cells.As shown in microarray,a totalof 20 differential geneswere found,14 ofwhich were upregulated and 6 were down-regulated.Their biologic functions demonstrate thatMB may exhibit anti-tumor activity against HL-60 cells by arresting cell cycle and reducing cellmetastasis.

Macranthoside B;MTT;PCR array;cell cycle;cell invasion and metastasis;HL-60 cells

R285.5;R733.7;Q946.83

A

1001-6880(2010)05-0765-05

2009-09-28 接受日期:2009-12-17

江蘇省自然科學(xué)基金(BK2008353);江蘇省藥用植物研究開發(fā)中心開放基金(2008001)

＊通訊作者 Tel:86-25-84347158;E-mail:fengxu@mail.cnbg.net