張 旭,趙芬琴,韓 光,劉 蕾,高 昕

1河南大學(xué)中藥研究所;2河南大學(xué)天然藥物研究所,開封 475004

樺褐孔菌的化學(xué)成分及抗炎活性

張 旭1,趙芬琴2＊,韓 光2,劉 蕾2,高 昕2

1河南大學(xué)中藥研究所;2河南大學(xué)天然藥物研究所,開封 475004

本實(shí)驗(yàn)研究了樺褐孔菌的化學(xué)成分及其抗炎活性。方法是采用溶劑法和柱色譜法提取分離樺褐孔菌的化學(xué)成分,根據(jù)化合物的理化性質(zhì)及核磁共振氫譜、碳譜、質(zhì)譜對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,然后采用二甲苯致小鼠耳腫脹和二甲苯致小鼠腹膜炎模型對(duì)所得化合物的抗炎活性進(jìn)行考察。最終從樺褐孔菌的乙醇提取物中分離得到 3個(gè)羊毛脂烷型三萜類化合物,分別鑒定為羊毛甾醇 (1)、inotodiol(2)和 trametenolic acid(3)。化合物1、2、3在 10 mg/kg均顯著抑制二甲苯致小鼠耳腫脹,化合物 1和 2在 10 mg/kg時(shí)顯著降低血管通透性。由此得出化合物 1～3均有抗炎活性,其中 trametenolic acid(3)的抗炎活性最強(qiáng)。

樺褐孔菌;化學(xué)成分;羊毛甾醇;inotodiol;trametenolic acid;抗炎

樺褐孔菌Inonotus obliquus(Pers.:Fr.)Pilat,屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、多孔菌科,分布于北半球45°～50°的地區(qū),在我國(guó)的黑龍江、吉林兩省資源較豐富。樺褐孔菌中主要含有羊毛脂烷型四環(huán)三萜類化合物,到目前為止已從樺褐孔菌中分離得到了 10余種新化合物,如 inotodiol[1,2]、3β-hydroxy-lanosta-8,24-dien-21-al、3β,22-dihydroxy-lanosta-7,9(11), 24-triene、3β,22-dihydroxy-lanosta-8,24-dien-7-one、25-methoxy-21,22-cyclolanosta-8-ene-3β,21-diol、3β, 22α-dihydroxy-lanosta-8,23E-diene-25-peroxide、3β, 22α,25-trihydroxy-lanosta-8,23E-diene、以及 3β-hydroxy-8,24-dien-lanosta-21,23-lactone、3β,22,25-trihydroxy-lanosta-8-ene、21,24-cyclopentalanosta-3β, 21,25-triol-8-ene[3-12]等均為僅存于樺褐孔菌中的羊毛脂烷型化合物。

三萜類成分的研究一直是天然藥物化學(xué)研究較為活躍的領(lǐng)域,亦是尋找和發(fā)現(xiàn)天然藥物生物活性成分的重要來源,其中四環(huán)三萜類具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗癌、抗突變、以及抗血小板聚集等心血管方面廣泛的生物活性[13,14],但對(duì)于羊毛脂烷型四環(huán)三萜類成分的抗炎活性研究卻報(bào)道甚少。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌中系列羊毛脂烷型化合物的抗炎活性研究未見報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)對(duì)樺褐孔菌中的羊毛脂烷型化合物及其抗炎活性進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

BrukerAdance 400核磁共振儀;Bruker Esquire質(zhì)譜儀;XT6顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀,溫度計(jì)未校正,(北京市科儀電光儀器廠);754型紫外可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

氫化可的松注射液,批號(hào) 0702141(鄭州羚銳制藥有限公司);柱色譜用硅膠 200～300目 (青島海洋化工)廠;其余試劑均為分析純。

樺褐孔菌子實(shí)體采自吉林省長(zhǎng)白山地區(qū),由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院傅偉杰教授鑒定為樺褐孔菌Inonotus obliquus(Pers.:Fr.)Pilat。

健康昆明種小鼠,體重 18～22 g,由河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 提取與分離

取樺褐孔菌干燥子實(shí)體的粗粉 950 g,用 95%乙醇回流提取,提取液合并后減壓回收溶劑,得乙醇提取物 41 g,將乙醇提取物采用反復(fù)的硅膠柱色譜分離,用氯仿-甲醇 (100:1→10:1)和石油醚-乙酸乙酯 (30:1→1:2)進(jìn)行梯度洗脫,分別得到化合物 1 (518 mg)、2(732 mg)、3(514 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物 1 白色針狀結(jié)晶 (甲醇),mp.137.3～137.9℃,FAB-MSm/z(%):426[M]+(5),408[MH2O]+(100)。

化合物 2 白色針狀結(jié)晶 (甲醇),mp.182.1～182.7℃,FAB-MSm/z(%):442[M]+(2.5),424 [M-H2O]+(100),406[M-2H2O]+(7)。

化合物 3 白色針狀結(jié)晶 (甲醇-石油醚),mp 244.1～245.9℃,FAB-MSm/z(%):456[M]+(2.5)?；衔?～3的1H NMR數(shù)據(jù)見表1,它們均在高場(chǎng)區(qū)出現(xiàn)五個(gè)角甲基的尖峰,這是四環(huán)三萜類化合物的典型特征;且它們的13C NMR數(shù)據(jù)分別與文獻(xiàn)報(bào)道的羊毛甾醇、inotodiol和 trametenolic acid對(duì)照一致[15,16](表 2),故分別鑒定化合物 1、2、3分別為羊毛甾醇 (lanosta-8,24-diene-3β-ol)、inotodiol (lanosta-8,24-diene-3β,22R-diol)和 trametenolic acid (3β-hydroxy-lanosta-8,24-dien-21-oic acid)。化合物1～3的結(jié)構(gòu)見圖 1。

圖 1 化合物 1～3的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compound 1～3

表 1 化合物 1～3的1H NMR數(shù)據(jù)(400 MHz)Table 11H NMR data of compound 1～3(400 MHz)

表 2 化合物 1～3與已知化合物的13C NMR化學(xué)位移比較(100 MHz)Table 213C NMR data of compounds 1～3(100 MHz)and the known compounds

4 抗炎活性研究[17,18]

4.1 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

雄性小鼠 45只,隨機(jī)分為 3組,每組 15只。正常對(duì)照 (Normal):腹腔注射生理鹽水,模型對(duì)照(Model):腹腔注射氫化可的松 20 mg/kg,藥物治療組:分別腹腔注射化合物羊毛甾醇 (1)、inotodiol (2)和 Trametenolic acid(3)10 mg/kg,各組注射容積均為 0.1 mL/10 g。給藥 30 min后,給小鼠右耳耳廓的前后兩面涂二甲苯 0.02 mL,30 min后處死小鼠,取下雙耳耳廓同一部位處直徑 8 mm的圓耳片,精密稱重。按下式計(jì)算腫脹率。

4.2 對(duì)二甲苯致小鼠腹膜炎的影響

小鼠 45只,雌雄兼有,隨機(jī)分為 3組,每組 15只,實(shí)驗(yàn)前剪去小鼠腹部正中腹部毛約 2.5 cm × 2.5 cm。正常對(duì)照(Normal):腹腔注射生理鹽水,模型對(duì)照(Model):腹腔注射氫化可的松 20 mg/kg,藥物治療組:分別腹腔注射化合物羊毛甾醇 (1)、inotodiol(2)和 Trametenolic acid(3)10 mg/kg,各組注射容積均為 0.1 mL/10 g。給藥 30 min后,給小鼠尾部靜脈注射 1%伊文氏藍(lán) 0.1 mL/10 g,注射后立即于小鼠腹部去毛處涂二甲苯 0.1 mL,30 min后處死小鼠,剝離腹部正中腹部皮膚,剪取染色皮膚直徑2.5 cm,剪碎,放入試管,加 5 mL丙酮-生理鹽水 (7: 3)液,浸泡 48 h(中間振搖 10次),1500 r/min離心15 min,取上清液于 610 nm處測(cè)吸光度 (以丙酮-生理鹽水 7:3調(diào)零)。

4.3 統(tǒng)計(jì)分析

4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.4.1 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

羊毛甾醇 (1)、Inotodiol(2)和 Trametenolicacid(3)10 mg/kg均顯著抑制小鼠耳腫脹 (表 3)。4.4.2 對(duì)二甲苯致小鼠腹膜炎的影響

羊毛甾醇 (1)、inotodiol(2)和 Trametenolic acid (3)在 10 mg/kg時(shí)均能顯著降低血管通透性,滲出的染料吸光度均低于氫化可的松組(表 3)。

表 3 化合物 1～3對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹和醋酸致小鼠胸腔腹膜炎的影響(±s)Table 3 Anti-inflammatory effects of compound 1～3 on mice ear edema induced by xylene and mice peritonitis induced by xylene(±s)

表 3 化合物 1～3對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹和醋酸致小鼠胸腔腹膜炎的影響(±s)Table 3 Anti-inflammatory effects of compound 1～3 on mice ear edema induced by xylene and mice peritonitis induced by xylene(±s)

注:＊P＜0.05,＊＊P＜0.01。

組別Group劑量Dose (mg/kg)腫脹率(%) Ear-s welling rate吸光度A610生理鹽水 - 60.8±34.9 0.821±0.284氫化可的松 20 25.9±23.1＊0.283±0.109＊羊毛甾醇 (1) 10 18.6±7.74＊0.269±0.222＊Inotodiol(2) 10 18.9±4.42＊0.274±0.171＊Trametenolic acid(3) 10 15.3±11.6＊0.152±0.087＊＊

5 結(jié)論與討論

羊毛甾醇 (1)、inotodiol(2)、trametenolic acid (3)均有抗炎活性,其中 trametenolic acid(3)的抗炎活性最強(qiáng),而羊毛甾醇 (1)和 inotodiol(2)的抗炎作用相當(dāng)?？梢?在羊毛甾醇的 22-位引入羥基后對(duì)其抗炎活性沒有影響;而 20-CH3變成 20-COOH后,即羊毛脂烷母核的 21-位氧化程度升高后,其抗炎活性增強(qiáng)。

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),羊毛甾醇 (1)、inotodiol(2)和trametenolic acid(3)的抗炎活性均強(qiáng)于氫化可的松,是否通過某些特殊的機(jī)制起到抗炎作用,尚有待進(jìn)一步研究。

1 Ludwiczak RS,W rzeciono U.Investigations of the chemical constituents ofInonotus obliquusI Inotodiol.Roczniki Chem, 1958,32:39-47.

2 Poyser JP.Stereospecific synthesis of inotodiol,3β,22R-dihydroxylanosta-8,24-diene.Tetrahedron,1974,30:977-986.

3 Kahlos K,Hiltunen R.3β-Hydroxylanosta-8,24-dien-21-al,a new triterpene fromInonotus obliquus.PlantaM ed,1984,50: 197-198.

4 Kahlos K.T wo new oxygenated lanostane type triterpenes fromInonotus obliquus.Acta Phar m Fenn,1986,95(2):71-76.

5 Kahlos K.3β,22-dihydroxy-lanosta-7,9(11),24-triene:a new,minor compound fromInonotus obliquus.Planta M ed,1986,52:495-496.

6 Kahlos K.3β,22-dihydroxy-lanosta-8,24-dien-7-one,a new 7-keto compound fromInonotus obliquus.Acta Phar m Fenn, 1986,95(3):113-117.

7 He J.Triterpenoids fromFuscoporia oblique.Chin Chem Lett, 2000,11(1):45-48.

8 He J(何堅(jiān)),Feng XZ(馮孝章).Studies on chemical constituents ofFuscoporia oblique.Chin Tradit HerbD rugs(中草藥),2001,32(1):4-6.

9 He J.Three new triterpenoids fromFuscoporia obliqua.J Asian Nat Prod Res,2001,3(1):55-61.

10 Shin Y.Chemical constituents ofInonotus obliquusI.A new triterpene,3β-hydroxy-8,24-dien-lanosta-21,23-lactone from sclerotium.Eurasian J For Res,2000,1:43-50.

11 Shin Y.Chemical constituents ofInonotus obliquus(Pers: Fr.)Pil.(Aphyllophoromycetide ae)III:A new triterpene, 3β,22,25-trihydroxy-lanosta-8-ene from sclerotia.Int J M ed M ushrooms,2000,2(3):201-207.

12 Shin Y.Chemical constituents ofInonotus obliquusII.A new triterpene,21,24-cyclopenta lanosta-3β,21,25-triol-8-ene from sclerotium.J W ood Sci,2001,47:313-316.

13 Jordan K Zjawiony.Biologically active compounds fromAphyllophorales(Polypore)fungi.J Nat Prod,2004,67:300-310.

14 Zhao FQ(趙芬琴),Piao HS(樸惠善).Anti-mutagenic constituents ofInonotus obliquus.Chin Tradit Herb D rugs(中草藥),2006,37:1777-1780.

15 Lukacs G,Khuong-Hun F.Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy of naturally occurring substances.lanosterol and dihydrolanosterol.Tetrahedron Letters,1972,(33): 3515-3518.

16 Kahlos K,Hiltunen R.3β-Hydroxy-lanosta-8,24-dien-21-al, a new triterpene fromInonotus obliquus.Planta M edica, 1984,50:197-198.

17 Xu SY(徐叔云),Bian RL(卞如濂),Chen X(陳修).PharmacologyMethod(藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)).Beijing:People’s Medical Publishing House,2003.911.

18 Han G(韓光),Du GJ(杜鋼軍),Xu QT(許啟泰),et al. Studies on synthesis of andrographolide trimaleic acid monoester and its antipyretic and anti-inflammatory activity.Chin Phar m J(中國(guó)藥學(xué)雜志),2005,40:628-631.

Chem ical Constituents and Anti-inflammatory Activities ofInonotus obliquus

ZHANG Xu1,ZHAO Fen-qin2＊,HAN Guang2,L IU Lei2,GAO Xin2

1Institute of ChineseM aterial,Henan University;2Institute of Natural Products,Henan University,Kaifeng 475004,China

To study the inflammatory activities of lanostane-type triterpenes inInonotus obliquus,the extracts ofI. obliquuswere chromatographed repeatedly to obtain the lanostane-type triterpenes contained.The structures of the compoundswere elucidated on the basis of spectroscopic analysis(1H NMR,13C NMR and MS)and their physicochemical properties.And their anti-inflammatory activitieswere observed inmicewith ear edema induced by xylene andwith peritonitis induced by xylene.3 lanostane-type triterpeneswere isolated from the extracts ofI.obliquusand theywere identified as lanosterol(1),inotodiol(2)and trametenolic acid(3)respectively.Lanosterol(1),inotodiol(2)and trametenolic acid(3)inhibited significantly ear edema inmice produced by xylene at10 mg/kg.Lanosterol(1)and inotodiol (2)reduced remarkably vascular per meability at 10 mg/kg.Lanosterol(1),inotodiol(2)and trametenolic acid(3) are all anti-infalmmatory compounds,amongwhich trametenolic acid(3)is the most active.

Inonotus obliquus;chemical constituents;lanosterol;inotodiol;trametenolic acid;anti-inflammatory

R9;Q58

A

1001-6880(2010)03-0433-04

2009-03-12 接受日期:2009-06-04

＊通訊作者 Tel:86-378-3880680;E-mail:zhaofenqin2005@yahoo. com.cn