孟如杰,田亞平

江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,無錫 214122

銀杏種仁中一種抗氧化活性蛋白的純化及性質(zhì)

孟如杰,田亞平＊

江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,無錫 214122

銀杏種仁經(jīng)破碎,提取緩沖液 4℃浸取后離心得上清液。上清液經(jīng)硫酸銨沉淀,DEAE-52離子交換層析,MonoQ離子交換層析,UltroGelACA-54凝膠過濾層析后,分離得到一種具有抗氧化活性的蛋白。該蛋白經(jīng)UltroGe lACA-54凝膠過濾層析測定分子量為 60 kD,經(jīng) PAGE和 SDS-PAGE鑒定均為單一蛋白質(zhì)條帶。SDSPAGE測定其亞基分子量為 10 kD。該蛋白具有一定的還原能力和清除超氧陰離子自由基及 DPPH自由基能力,并在 30～60℃溫度下具有良好的穩(wěn)定性。

銀杏;種仁蛋白;純化;抗氧化

銀杏 (Ginkgo bilobaL.)為我國特有的植物。近年來,銀杏資源的開發(fā)受到人們很大的關(guān)注,銀杏葉以及銀杏外種皮的開發(fā)更是成為國際性的熱點[1-2]。銀杏種仁是銀杏資源的重要組成部分,其作為一種具有保健作用的食品,在中國已有很長的歷史。銀杏種仁含有藥用成分,具有抑制真菌、抗過敏等作用。但是,國內(nèi)對銀杏種仁的化學(xué)成分和生物活性物質(zhì)的研究報道不多。2000年,HexiangWang等從銀杏果仁中分離出一個新的抗菌蛋白,分子量為 13 kD,具有抑制反轉(zhuǎn)錄酶的活性[3]。牛衛(wèi)寧等經(jīng)過兩次柱層析,也分離得到一種分子量為 13 kD的抗菌蛋白[4]。黃文等通過鹽溶和鹽析,分析了銀杏種仁蛋白的組成,并報道了銀杏種仁蛋白具有體外抗氧化作用和抗生物氧化作用,且具有體外抗氧化作用的主要為水溶性蛋白[5,6]。

本文采用硫酸銨沉淀和離子交換層析等方法對銀杏種仁中具有抗氧化作用的蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的分離,得到一種分子量為 60 kD具有較好的體外抗氧化活性的蛋白,并對其部分性質(zhì)進(jìn)行了研究

1 材料與方法

1.1 試驗材料

銀杏種仁本地市售,原料經(jīng)冷凍后,碾碎備用。

1.2 試劑

DEAE-52離子交換纖維素為Amersham生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,MonoQ為 Phar macia公司產(chǎn)品,UltroGelACA-54為 Reactifs IBF公司產(chǎn)品。二苯代苦味酰自由基(DPPH)為 Sigma公司產(chǎn)品,標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白購自上海博亞生物有限公司,考馬斯亮藍(lán) R 250為上海生工產(chǎn)品。其它生化試劑為國產(chǎn)和進(jìn)口分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 抗氧化蛋白的制備與純化

150 g碾碎的銀杏種仁,加入 500 mL提取緩沖液 (50 mmol/L磷酸緩沖液 pH 7.0,0.1 mol/L KCl, 2 mmol EDTA),在 4℃下過夜浸取。過濾后,8000 r/min離心 10 min,上清液加入硫酸銨至 30%飽和度,靜置,待沉淀完全后,8000 r/min離心 10 min,收集上清液。加入硫酸銨至 80%飽和度,8000 r/min離心 30 min,收集沉淀,用少量緩沖液溶解后透析。12000 r/min離心 10 min,收集上清液得到蛋白質(zhì)粗提取液。

DEAE-52離子交換層析 DEAE-52離子交換纖維素層析柱(2×15 cm),將粗蛋白提取液用磷酸緩沖液調(diào) pH 6.5,上樣,起始緩沖液為 pH 6.5,0.02 mol/L的磷酸緩沖液。洗脫緩沖液為含 0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L的NaCl,pH 6.5的磷酸緩沖液,階段洗脫,流速 1 mL/min。在 280 nm波長下檢測,收集峰液,以DPPH法檢測抗氧化活性。

MonoQ離子交換層析將有活性的部分濃縮脫鹽,用磷酸緩沖液調(diào)整 pH為 7.0,上MonoQ離子交換層析柱 (1×10 cm),起始緩沖液為 pH 7.0,0.02 mol/L的磷酸緩沖液。線性梯度洗脫,緩沖液為 pH 7.0,0.02 mol/L的磷酸緩沖液,NaCl的濃度在 30 min內(nèi)由 0.01 mol/L增加到 0.4 mol/L,流速 1 mL/ min,在 280 nm波長下檢測,收集峰液,適當(dāng)濃縮后以DPPH法檢測抗氧化活性。

UltroGelACA-54凝膠過濾層析 UltroGelACA-54層析柱 (1.5×80 cm),用 pH 7.0,0.02 mol/L的磷酸緩沖液平衡,將收集到的樣品適當(dāng)濃縮后上柱,用同種緩沖液洗脫,流速為 1 mL/min,收集峰液備用。

1.3.2 蛋白質(zhì)純度鑒定以及分子量的測定

UltroGelACA-54凝膠過濾層析測定分子量:用以下四種已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)定 UltroGe lACA-54柱 (1.5×80 cm)。胰蛋白酶 (Mr 23300),胃蛋白酶 (Mr 35000),卵清蛋白 (Mr 45000),牛血清白蛋白(Mr 68000),流速 1 mL/min,分別測出洗脫體積Ve,同時計算這些分子相應(yīng)的值 lg Mr,以Ve對 lg Mr作圖,得到分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。相同條件下測定樣品的Ve,并計算分子量。

SDS-PAGE:分離膠濃度 15%,Tris-HCl,pH 8.9的分離膠緩沖液,濃縮膠濃度 5%,Tris-HCl,pH 6.8的濃縮膠緩沖液,恒壓 200 V,電泳 1 h。

PAGE:聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)法,分離膠濃度 12%,Tris-HCl,pH 8.9分離膠緩沖液,恒壓100 V,電泳 1.5 h。

電泳后均用考馬斯亮藍(lán) R-250染色,含 10%醋酸和 10%甲醇的脫色液脫色。

1.3.3 蛋白質(zhì)以及糖濃度的測定

福林-酚法測蛋白質(zhì)含量,以牛血清白蛋白為對照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。苯酚-硫酸法測糖含量,以葡萄糖為對照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 抗氧化活性和熱穩(wěn)定性測定

將待測樣品統(tǒng)一調(diào)整蛋白濃度為 1 mg/mL。1.3.4.1 還原能力的測定[7]在比色管中分別加入0.2、0.4、0.8 mL的樣品,加蒸餾水至 1 mL。加入2.5 mL的磷酸緩沖液 (0.2 mol/L,pH 6.6),再加入1%鐵氰化鉀 2.5 mL?；旌衔?50℃水浴 20 min后加入 1 mL 10%的三氯乙酸。取 2.5 mL反應(yīng)液,加入蒸餾水 2.5 mL和 0.1%氯化鐵 0.5 mL。在 700 nm處測吸光值。吸光值越高說明樣品的還原性越強(qiáng)。以 0.5 mg/mL的抗壞血酸為參照。

1.3.4.2 清除超氧陰離子自由基能力的測定[8]

在比色管中分別加入 0.2、0.4、0.8 mL樣品,加蒸餾水至 1 mL。加入 Tris-HCl溶液 (pH 8.2)5.0 mL和 50 mmol/L鄰苯三酚溶液 1 mL,迅速搖勻,以蒸餾水為空白對照。每 30 s在 325 nm處測定吸光值。按下式計算清除率。

式中,F0為鄰苯三酚的自氧化速率;Fs為加樣品的反應(yīng)溶液吸光值的變化率。

1.3.4.3 清除DPPH自由基能力的測定[9]

在試管中加入 0.01%的DPPH乙醇溶液 2 mL,然后加入 2 mL,各含 0.2、0.4、0.8 mL樣品的溶液,搖勻,在 30℃水浴 30 min,以同體積的水代替樣品溶液作為對照。在 517 nm下測定吸光值。按下式計算清除率。

式中,A0為對照的吸光值;As為樣品的吸光值。

1.3.4.4 熱穩(wěn)定性實驗

將樣品溶液分別經(jīng)過 30、40、50、60、70、80℃水浴處理 30 min后,以 DPPH法測抗氧化活性,加入樣品 0.8 mL。30℃時為標(biāo)準(zhǔn)情況。

2 結(jié)果

2.1 抗氧化活性蛋白的分離純化

150 g銀杏種仁提取液經(jīng)過欲處理后,調(diào)整 pH為 6.5上DEAE-52離子交換層析柱,起始緩沖液為pH 6.5,0.02 mol/L的磷酸緩沖液。洗脫緩沖液為含 0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L的 NaCl,pH 6.5的磷酸緩沖液,階段洗脫,得到 4個洗脫峰,按洗脫順序分別記為B1、B2、B3和 B4。以 DPPH法檢測抗氧化性。經(jīng)檢測 B2的抗氧化活性較高,且蛋白含量也較高。收集峰B2。見圖 1。

圖 1 銀杏種仁蛋白的DEAE-52離子交換層析Fig.1 Chromatography of protein of seeds on DEAE-52

將 DEAE-52層析得到的峰 B2適當(dāng)濃縮脫鹽后,用磷酸緩沖液調(diào)整 pH為 7.0,上樣MonoQ離子交換層析柱,起始緩沖液為 pH 7.0,0.02 mol/L的磷酸緩沖液,線性梯度洗脫,緩沖液為 pH 7.0,0.02 mol/L的磷酸緩沖液,NaCl的濃度在 30 min內(nèi)由0.01 mol/L增加到 0.4 mol/L。如圖 2所示,得到兩個峰,按洗脫順序分別記為 C1和 C2,經(jīng)以DPPH法檢測峰 C1的抗氧化性較高,收集峰 C1,見圖 2。

圖2 MonoQ離子交換層析Fig.2 Chromatography ofB2 onMonoQ

以 UltroGelACA-54對 C1做進(jìn)一步純化,并測定其蛋白質(zhì)相對分子量。結(jié)果為只有一個洗脫峰E1,已無雜蛋白峰,收集峰液,測定蛋白濃度,濃縮脫鹽待用。

用苯酚-硫酸法測糖含量,結(jié)果表明該蛋白質(zhì)樣品中沒有糖,說明該蛋白不是糖蛋白。

表 1為每一步純化后,測定的蛋白含量和其所占的比例。以 150 g銀杏種仁提取液經(jīng) 80%硫酸銨沉淀得到的蛋白為 100%計。

2.2 蛋白質(zhì)純度鑒定以及分子量的測定

經(jīng)UltroGelACA-54凝膠過濾層析測定蛋白 E1的分子量,分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=-150.58x+767.34=0.9628。收集到洗脫液 Ve=48 mL。經(jīng)計算,分子量為 60 kD。PAGE鑒定其純度,為單一條帶, SDS-PAGE鑒定蛋白質(zhì)亞基也為單一條帶,分子量為 10 kD,如圖 3,初步推測該蛋白由單一亞基構(gòu)成,亞基數(shù)為 6個。

表 1 每步純化后所得蛋白量Table 1 Contents of protein of each step of purification

圖 3 銀杏種仁蛋白 E1的聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.3 Polyacrylamide gel electrophoresis of E1

圖 3中 1、2為UltroGelACA-54凝膠過濾層析蛋白組分 E1。3為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白,由上到下依次為兔磷酸化酶 (97400),牛血清白蛋白 (66200),兔肌動蛋白 (43000),牛碳酸酐酶 (31000),胰蛋白酶抑制劑 (20100),雞蛋清溶菌酶 (14400)。4、5為 UltroGelACA-54凝膠過濾層析蛋白組分 E1。15%的分離膠適于分離 10～40 kD的蛋白質(zhì),所以以兔肌動蛋白、牛碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制劑和雞蛋清溶菌酶為準(zhǔn)進(jìn)行計算。

2.3 抗氧化活性蛋白的部分性質(zhì)

2.3.1 抗氧化活性的測定

2.3.1.1 還原能力的測定

加入不同量的銀杏蛋白,按照 1.3.4.1的方法進(jìn)行還原能力的測定,以反應(yīng)體系的吸光值和加入樣品的量作圖,同時以抗壞血酸為對照,結(jié)果如圖4。

由圖 4可知,樣品有較明顯的還原能力,還原能力隨加入量的增大而增加。但明顯低于抗壞血酸。

圖 4 銀杏種仁蛋白 E1的還原能力Fig.4 The effective reducing power of E1

2.3.1.2 清除超氧陰離子自由基的測定

按照 1.3.4.2的方法進(jìn)行清除超氧陰離子自由基能力的測定,以樣品清除率和加入樣品的量作圖。

圖 5 銀杏種仁蛋白 E1清除超氧陰離子自由基的能力Fig.5 The scavenging effect of superoxide anion of E1

由圖 5可知,樣品具有清除超氧陰離子自由基的能力,清除率隨加入量的增大而增加?？傮w來說,在低濃度情況下清除能力不高,在比較高的濃度下,清除率較為顯著。加入樣品體積達(dá)到 0.8 mL時,清除率達(dá)到了 34%。

2.3.1.3 清除DPPH自由基能力的測定

按照 1.3.4.3的方法進(jìn)行清除DPPH自由基能力的測定,以樣品清除率和加入樣品的量作圖。

圖 6 銀杏種仁蛋白 E1清除DPPH自由基自由基的能力Fig.6 The scavenging effect ofDPPH radical of E1

由圖 6可知,樣品具有較好的清除DPPH自由基能力,清除率隨加入量的增大而增加。在低濃度時,清除率隨濃度增加很快,達(dá)到一定的量后,清除率增加減緩。加入樣品體積達(dá)到 0.8 mL時,清除率為54%。

2.3.2 熱穩(wěn)定性實驗

樣品溶液分別經(jīng)過 30、40、50、60、70、80℃水浴處理 30 min后,DPPH法測抗氧化活性,結(jié)果如圖。

圖 7 溫度對銀杏種仁蛋白 E1的影響Fig.7 Thermal stability of E1

由圖 7可知,該銀杏種仁蛋白在 30～50℃的溫度范圍內(nèi)清除率沒有大的變化,當(dāng)處理溫度達(dá)到 60℃時,清除率開始緩慢下降,可能是由于較高的溫度會使蛋白質(zhì)的部分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變,從而使抗氧化活性下降。

3 討論

氧在生物體內(nèi)通過單電子還原產(chǎn)生化學(xué)性質(zhì)活潑的物質(zhì),既活性氧 (ROS),包括超氧陰離子,羥基自由基等。它們可與DNA,蛋白質(zhì)和多元不飽和脂肪酸作用,造成DNA的斷裂和氧化性損傷,蛋白-蛋白交聯(lián),蛋白-DNA交聯(lián)等,從而造成生物體氧化損傷,并進(jìn)一步引起癌癥,衰老,心血管等慢性病[10]。人體從外源,主要是食物當(dāng)中獲得抗氧化劑有助于減輕生物體的氧化損傷。

銀杏種仁經(jīng)研究,具有耐缺氧,延緩衰老等作用,除了研究較為廣泛的酚類,黃酮類物質(zhì)外,銀杏種仁中含有大量的蛋白質(zhì),可占干重的 10%,并有較強(qiáng)的抗氧化活性,對其組成成分展開較為深入的研究,將使人們對銀杏種仁的保健藥理作用有更全面的認(rèn)識。本文報道了從銀杏種仁中分離出一種具有較好抗氧化活性,且含量較高的蛋白質(zhì) E1。該蛋白具還原能力,較好的清除羥基自由基的能力,對超氧陰離子也有一定的清除能力,在 30～50℃的水浴處理后仍保持穩(wěn)定。對于該蛋白抗氧化的機(jī)理與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系及銀杏種仁中其他活性蛋白的分離還有待進(jìn)一步研究。

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Purification and Characterization of an Antioxidant Active Protein fromGinkgo bilobaSeed

MENG Ru-jie,T IAN Ya-ping＊
The Key Laboratory of Industrial B iotechnology,M inistry of Education,Jiangnan University,W uxi 214122,China

An antioxidant active proteinwas isolated from the seeds of Ginkgo biloba by using the ammonium sulfate precipitation,the DEAE-52 and MonoQ ion-exchange chromatography,and the UltroGelACA-54 gel filtration chromatography.The protein gave a single band on PAGE and SDS-PAGE.The totalmolecularweight of the protein was 60 kD and the molecularweightof subunitwas 10 kD.The protein showed the capabilityof reducingpower,superoxide anion radical scavenging,and free radical scavenging activity,and was stable at the temperature of 30-60℃.

Ginkgo biloba;protein of Ginkgo biloba seed;purification;antioxidant activity

R284.2;Q946

A

1001-6880(2010)03-0388-05

2008-04-28 接受日期:2008-08-29

＊通訊作者 Tel:86-532-88963253;E-mail:yapingtian@hotmail.com