馮 紅，武晶瓊，周春明，何慶華，溫 利

6周無負重游泳運動降低SHR大鼠血壓的血漿蛋白質(zhì)組學研究

馮 紅1，武晶瓊2，周春明2，何慶華2，溫 利3

目的：運用比較蛋白質(zhì)組學技術，探討6周無負重游泳運動降低SHR大鼠血壓血漿蛋白質(zhì)表達的變化，以期進一步闡述運動治療高血壓病的機制。方法：以雄性4周齡SHR大鼠16只及WKY大鼠16只為研究對象，將其隨機分為SHR運動組、SHR安靜組、WKY安靜組、WKY運動組。SHR運動組及WKY運動組進行1 h/天，5天/周，共6周的無負重游泳運動。使用CODATM2單通道無創(chuàng)血壓測量儀檢測老鼠血壓，對處理好的血漿樣品進行二維凝膠電泳和質(zhì)譜分析。結果：（1）6周無負重游泳運動可以有效降低SHR大鼠的血壓。（2）通過質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索，成功鑒定了6個差異蛋白：rCG45257、錨定蛋白重復域13家族成員D、甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白A鏈、Ras相關域1家族同型A、胎球蛋白B前體和γ-肌動蛋白。

6周無負重游泳運動；高血壓；血漿蛋白質(zhì)組學；SHR

高血壓嚴重危害人類的生命健康。目前關于高血壓，特別是原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制尚不十分了解，體力活動是其中一個重要的環(huán)境因素。最近的研究發(fā)現(xiàn)，體力活動水平和血壓呈負相關。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)體力活動具有降壓的作用。長期從事體力活動具有明顯和穩(wěn)定的降壓作用，而且可以減少降壓藥物的劑量[1]。目前對高血壓運動干預的分子生物學研究已取得了一些進展。研究發(fā)現(xiàn)，運動可以引起與血壓有關的多個關鍵蛋白質(zhì)表達的改變，但以往關于高血壓運動干預的研究技術，受限于多種蛋白質(zhì)的分析效率和鑒定靶蛋白的特異抗體的有效性，不能全面分析高血壓運動干預時機體的變化。本研究擬采用比較蛋白質(zhì)組學分析法，系統(tǒng)地進行運動改善高血壓血漿相關蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組研究，通過對運動改善高血壓大鼠模型的建立、大鼠血漿蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的制備、分析與鑒定，尋找差異表達蛋白并探討其功能，從蛋白質(zhì)組學的角度探索運動治療高血壓的分子機制。

1 實驗材料

1.1 動 物

以4周齡，雄性，SHR大鼠（16只）及WKY大鼠（16只）為研究對象，SHR大鼠隨機分為SHR安靜組（n=8），SHR運動組（n=8），WKY大鼠隨機分為WKY安靜組（n=8），WKY運動組（n=8），4組均在通風、恒溫（24±1）℃、濕度適宜、自然采光的動物室內(nèi)飼養(yǎng)。

1.2 試 劑

雙向電泳試劑及蛋白定量試劑盒均購自Amersham Pharmacia公司，乙腈、水及甲酸購于Merck公司。TPCK修飾的測序級胰蛋白酶購于Promega公司。蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）及高豐度蛋白去除試劑盒購自Merck公司，蛋白銀染試劑盒及DNA酶購自GE Amersham Biosciences公司。

作者單位：1.天津體育學院健康與運動科學系，天津300381；2.天津體育學院研究生部，天津300381；3.山西省呂梁市人民醫(yī)院體檢中心，山西呂梁3000031。

1.3 設 備

GE Amersham Biosciences公司蛋白質(zhì)學研究配套儀器：IPGphor等電聚焦儀，Ettan DALTⅡ雙向垂直電泳儀，ImageMaster 2D Platinum 6．0凝膠圖像分析軟件，Labscan掃描控制和分析前處理軟件，Imagescanner掃描儀。DU800型可見-紫外分光光度計來自Beckman公司，液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀LCQ Deca XP來自Thermo Electron公司。

2 實驗方法

2.1 建立運動改善自發(fā)性高血壓大鼠血壓的模型

2.1.1 運動方案 大鼠適應飼養(yǎng)環(huán)境一周后，進行一周適應運動，水溫36℃，水深50 cm，從15 min開始遞增，第7天時可以游1 h。以后在水溫36℃，水深50 cm條件下進行無負重游泳運動，1 h/天，5 天/周，共運動 6 周。

2.1.2 血壓的測定 使用CODATM2單通道無創(chuàng)血壓測量儀，每周檢測大鼠血壓一次，每只大鼠的測量時間盡量固定在同一時間。

2.1.3 取 材 用10%的水合氯醛麻醉大鼠，麻醉滿意暴露大鼠腹主動脈，以5 mL一次性注射器，針尖斜面向上刺入腹主動脈，緩慢抽血，約5 mL。拔去針頭，輕輕推入5 mL抗凝管中，室溫下，3 000 r/min，離心15 min，吸取上層血漿，并分裝于200 μL離心管，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，避免反復凍融?/p>

2.1.4 去除高豐度蛋白 使用德國Merck去除高豐度蛋白試劑盒，快速、高度特異性地除去血漿中的白蛋白免疫球蛋白IgG，以利于低豐度蛋白的檢測，并對處理后的樣品以考馬斯亮藍法進行蛋白定量。

2.2 制備血漿二維凝膠電泳圖譜

2.2.1 第一向等電聚焦 用樣品溶解緩沖液（9 M尿素，4%CHAPS，2%IPG 緩沖液，40 mM DTT，40 mM Tris-base） 溶解樣品。處理好的樣品250 μg，加入水化液，使樣品和水化液的總體積等于 450 μl。等電聚焦參數(shù)：30 V，12 h；200 V，1 h；500 V，1 h；1000 V，1 h；8 000 V，9 h。

2.2.2 第二向SDS電泳 IPG膠條平衡2次，每次10 min，平衡緩沖液包括6 M尿素和30%甘油。將平衡好的IPG膠條小心放置于制好的SDS膠面上，使IPG膠條與SDS膠面充分結合，0．5%的瓊脂糖溶液封頂。二向電泳參數(shù)為：1 W/膠條 1 h；10 W/膠條5 h。當溴酚藍染料遷移到膠的底部邊緣即可結束電泳?？捡R斯亮藍染色6 h，脫色12 h。染色凝膠用Imagescanner掃描儀進行掃描，ImageMaster 2D Platinum 6．0凝膠圖像分析軟件分析電泳結果。圖像分析時將SHR運動組的凝膠選做參考膠，其他組膠與參考膠進行匹配。蛋白質(zhì)點歸一化定量后輸出數(shù)據(jù)到Microsfot Excel 2000中進行統(tǒng)計分析，差異顯著性分析采用 Student's T-Test。

2.3 差異候選蛋白的質(zhì)譜分析

2.3.1 蛋白斑點的脫色和膠上原位酶切 選取二維電泳凝膠上的候選蛋白斑點，并切成1 mm2大小的膠片，另切一塊無蛋白的2-DE凝膠作為空白對照，置于EP管中，-20℃凍存。將切下的膠片用去離子水沖洗3次，用50%丙烯腈/25 mmol/L碳酸氫銨水溶液（400 μL，pH8．0）振蕩脫色，膠塊真空離心干燥。加入10～15 μL胰蛋白酶液，覆蓋膠塊，4℃放置30 min，吸脹后，吸出多余酶液，37℃空氣浴16～20 h。

2.3.2 肽混合物的提取 吸出反應液，置E P管中，加入50%AC/5%TEA水溶液溶解，輕微振蕩萃取60分，離心吸上清，置前一EP管中，再萃取一次。合并萃取液（反應液和兩次萃取液）冷凍真空抽干約l h，4℃冰箱保存。

2.3.3 質(zhì)譜分析 濃縮后的肽段抽提液通過C18-高壓液相色譜儀偶聯(lián)的裝有自動進樣器、微量電噴霧離子化源及離子阱質(zhì)量分析器的液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀LCQ Deca XP進行分析。

2.4 數(shù)據(jù)庫檢索初步鑒定蛋白質(zhì)

數(shù)據(jù)庫檢索程序根據(jù)輸入的蛋白質(zhì)等電點、分子量范圍及肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)和其他一些參數(shù)在數(shù)據(jù)庫中尋找與這些參數(shù)相匹配的蛋白質(zhì)。檢索數(shù)據(jù)庫為：htto：／／www．matrixscience．com。

2.5 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據(jù)由SPSS統(tǒng)計軟件（SPSS13．0 for Windows）處理，計算均值和標準差（±S），組間比較采用雙因素方差分析，組內(nèi)比較采用配對T檢驗，顯著性標準為：P＜0．05。

3 實驗結果

3.1 6周無負重游泳運動對SHR大鼠和WKY大鼠血壓的影響

4組大鼠6周游泳訓練前，收縮壓、舒張壓、平均動脈壓的情況見表1。運動前，SHR大鼠收縮壓、舒張壓、平均動脈壓明顯高于WKY大鼠；SHR大鼠隨周齡增長，收縮壓、舒張壓、平均動脈壓呈持續(xù)上升趨勢。運動后，SHR大鼠收縮壓、舒張壓、平均動脈壓仍然高于WKY大鼠，且SHR安靜組的增高幅度顯著高于SHR運動組，P＜0．01。游泳運動訓練后的SHR運動組大鼠收縮壓、舒張壓、平均動脈壓與SHR安靜組大鼠相比第4周即開始下降，運動6周后降低具有顯著性P＜0．01；6周游泳訓練后，SHR運動組收縮壓、舒張壓、平均動脈壓較運動前沒有顯著性變化，但SHR安靜組這3個指標比6周前顯著升高，P＜0．05。WKY大鼠運動組和安靜組在這6周內(nèi)收縮壓、舒張壓、平均動脈壓的變化均不具有顯著性。

3.2 各組血清蛋白質(zhì)2-DE圖譜的制備和比較

3.2.1 各組血漿蛋白質(zhì)2-DE譜圖的制備 將去除高豐度蛋白后的SHR運動組，SHR安靜組，WKY安靜組，WKY運動組血漿進行二維凝膠電泳。圖象經(jīng)ImageMaster 2D Platinum 6．0凝膠圖像分析軟件分析發(fā)現(xiàn)，在SHR安靜組蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)674個蛋白點，在SHR運動組蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)644個蛋白點，在WKY安靜組蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)695個蛋白點，在WKY運動組蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)627個蛋白點。以SHR運動組血漿蛋白質(zhì)2-DE譜圖中作為參考膠，其他譜圖與之匹配，WKY安靜組血漿蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖的平均匹配率為 73．0396%，WKY運動組血漿蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖的平均匹配率為74．1149%，SHR安靜組血漿蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖的平均匹配率為77．3900%。

表1 6周無負重游泳運動對SHR大鼠和WKY大鼠血壓的影響（mmg）Table 1 Effects of six-week load-free swimming on the blood pressure in SHR and WKY rats（mmg）n=8

3.2.2 運動改善高血壓血漿蛋白質(zhì)的表達變化 經(jīng)過對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，SHR運動組與SHR安靜組相比較，共發(fā)現(xiàn)13個蛋白點的含量發(fā)生了明顯改變，其中在SHR運動組血漿中有6個蛋白點升高，7個蛋白點降低；SHR運動組與WKY運動組相比較，有33個蛋白點的含量發(fā)生了明顯改變，其中在SHR運動組血漿中有8個蛋白點升高，25個蛋白點降低；SHR運動組與WKY安靜組相比，27個蛋白點的含量發(fā)生了明顯改變，其中在SHR運動組血漿中有20個蛋白點升高，7個蛋白點降低；SHR安靜組與WKY安靜組相比較，發(fā)現(xiàn)33個蛋白點發(fā)生了明顯改變，其中在SHR安靜組血漿中8個蛋白點升高，25個蛋白點降低。它們在凝膠中的位置見圖1所示。統(tǒng)計分析顯示這些差異蛋白點的相對含量均具有顯著性差異。

圖1 運動改善高血壓血漿中表達差異的蛋白點分析Fig.1 Analysis of proteins for different expression in plasma under the condition of high blood pressure after exercise

3.3 差異蛋白質(zhì)的鑒定

選取有顯著改變的6個差異蛋白點，經(jīng)過膠內(nèi)酶切和MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析后，得到了各個蛋白點的肽質(zhì)量指紋譜圖，鑒定出了6個差異表達的蛋白質(zhì)（見表2）。與SHR安靜組相比，3個蛋白質(zhì)在SHR運動組血漿中含量升高，這些蛋白包括：錨定蛋白重復域13家族成員D、胎球蛋白B前體和γ-肌動蛋白。3個蛋白質(zhì)在SHR運動組血漿中含量降低包括：甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白A鏈、Ras相關域1家族同型A和rCG45257。

4 討 論

4.1 6周無負重游泳運動對SHR大鼠和WKY大鼠血壓的影響

Song等人的研究指出，4周游泳訓練可以使SHR大鼠收縮壓由 （208．4±6．8）mmHg 顯著下降到 （187．2±4．1）mmHg[2]。Bobillier等人發(fā)現(xiàn)3周齡雄性SHR大鼠經(jīng)過8周游泳訓練后收縮壓下降了24 mmHg[3]。Vogt亦認為游泳運動可以使SHR大鼠運動組比安靜組收縮壓和舒張壓顯著下降[4]。本實驗結果顯示，與SHR安靜組相比，SHR運動組血壓4周開始下降，至6周末非常顯著性下降（P＜0．01），說明6周無負重游泳運動能有效降低SHR大鼠的血壓。

表2 鑒定出的蛋白質(zhì)的名稱Table 2 ldentified proteins

4.2 運動改善SHR大鼠血壓的血漿蛋白質(zhì)組學分析

應用雙向凝膠電泳技術對去除白蛋白后的大鼠血漿進行分析，選取6個濃度上變化比較大的蛋白點進行質(zhì)譜鑒定。其中有4個蛋白既在運動改善SHR血壓過程中有變化，又在SHR發(fā)病過程中有變化即：rCG45257、錨定蛋白重復域13家族成員D、甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白A鏈、Ras相關域1家族同型A；有2個蛋白只在運動改善SHR血壓過程中發(fā)生變化，它們分別是胎球蛋白B前體和γ-肌動蛋白。由于rCG45257是尚未被命名的蛋白產(chǎn)物，現(xiàn)將主要蛋白的功能總結如下。

4.2.1 甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白A鏈 甲狀腺素運載蛋白在體內(nèi)大多數(shù)為同源四聚體，少數(shù)以單體形式存在[5]。其每個亞單位含有125～136個氨基酸序列，這些氨基酸序列形成β折疊結構，以利于維持分子結構的穩(wěn)定性[6]。臨床和基礎研究均發(fā)現(xiàn)，甲狀腺素運載蛋白與老年全身性淀粉樣變性、家族性淀粉樣多神經(jīng)病、家族性淀粉樣心肌病有一定的相關性。但至今尚無甲狀腺素運載蛋白A鏈的相關報道。

4.2.2 Ras相關域家族1同型A Rass相關域家族1（Rassf1）蛋白是腫瘤抑制基因的產(chǎn)物，得到了大家廣泛的關注[7-9]。Rassf1的編碼基因位于染色體3p21．3上，大約 11 000 bp，它包括8個外顯子和2個不同的啟動子，進行選擇性剪接后可以形成8個不同的轉(zhuǎn)錄物，即Rassf1A-Rassf1H。目前只有Rassf1A和Rassf1C的生物學意義被廣泛研究[10]。Rassf1A分子量為39 kDa，包含340個殘基。Rassf1A和Rassf1C在C-氨基端有4個相同的外顯子，Rassf1A的N-氨基端有一個鋅指結構，與蛋白激酶C保守區(qū)域C1具有很高的同源性[11]。

Rassf1A已經(jīng)被公認為在各種腫瘤中的腫瘤抑制因子[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，Rassf1 A經(jīng)常在許多癌癥細胞鏈和新生組織中缺失[11，14-15]。Rassf1A具有傳遞抑制生長的信號的功能，在腫瘤形成過程中這些起抑制作用的信號通路可能會被滅活Rassf1A在C-氨基端Salvador Rassf Hippo（SARAH）區(qū)后的，與蛋白相互作用有關的Ras相關區(qū)域（RA區(qū)）發(fā)揮這些生物學作用[16]。Rassf1A已經(jīng)被證明可以和有活性的Ras即Ras．GTP相結合提示它可能是Ras的一種效應器。Rassf1A已經(jīng)被證明存在于心肌細胞中，并且與鈣離子泵在肌漿中有相同的定位點[17]。持續(xù)的機械壓力存在時，Rassf1A缺乏會通過增加ERK1/2信號通路的活性，引起心肌肥大和心室結構改變。

4.2.3 γ-肌動蛋白 γ-肌動蛋白的分子量為43 KD，根據(jù)氨基酸和cDNA序列可將γ-肌動蛋白分為平滑肌γ-肌動蛋白和胞漿γ-肌動蛋白。哺乳動物中通常γ-肌動蛋白分布在內(nèi)臟器官平滑肌，而血管平滑肌主要分布為α-肌動蛋白。肌動蛋白亞型表達與平滑肌分化狀態(tài)之間的有一定的聯(lián)系，平滑肌細胞處于分化狀態(tài)時γ-肌動蛋白表達增加和α-肌動蛋白表達降低，去分化狀態(tài)時肌動蛋白亞型的表達正好相反[18]。有學者推測，γ-肌動蛋白表達增加及其轉(zhuǎn)運到細胞膜可能通過以下機制促進平滑肌收縮：增加組織中收縮蛋白含量和支持肌細胞與周圍膠原蛋白基質(zhì)的相互作用[19]。平滑肌細胞是血管中最主要的細胞，其主要功能在于維持血管結構與血壓的調(diào)控。當血管處于病變情況下，平滑肌細胞表型的改變是一個主要的特征。很多學者對管壁壓力對容量血管的影響進行了大量研究，并一致認為：管壁壓力可以通過擴張血管容量，重塑管腔結構來維持組織的物理應力處于相對正常水平。在此過程中，血管平滑肌細胞收縮以彌補血管損傷部位的再生障礙，其發(fā)生機制類似于血管成形術后的動脈粥樣硬化和再狹窄[20]。此外，有文獻報道，當心臟擴大和肥厚的小鼠特異性心臟α-肌動蛋白缺陷時內(nèi)臟平滑肌γ-肌動蛋白的異位表達來彌補[21]。而且細胞質(zhì)中多余的的γ-肌動蛋白是肌營養(yǎng)不良蛋白的缺失時會導致細胞信號傳導或基因表達異常的原因[22]。

5 結 論

（1）6周無負重游泳運動可以有效降低SHR大鼠的血壓。（2）通過質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索，成功鑒定了6個差異蛋白，分別為：既在運動改善SHR血壓過程中有變化，又在SHR發(fā)病過程中有變化的蛋白質(zhì)：rCG45257、錨定蛋白重復域13家族成員D、甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白A鏈、Ras相關域1家族同型A；只在運動改善SHR血壓過程中發(fā)生變化的蛋白質(zhì)：胎球蛋白B前體和γ-肌動蛋白。

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Plasma Proteomics of Six-Week Load-Free Swimming Training Decreasing Blood Pressure in SHR

FENG Hong1，WU Jingqiong2，ZHOU Chunming2，HE Qinghua2，WEN Li3
（1.Dept.of Health&Exercise Science，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China；2.Dept.of Postgraduate，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China；3.Medical Center of Luliang People's Hospital，Luliang 3000031，China）

Objective：Using the comparative proteomics method，the plasma protein expression was examined under the situation of blood pressure decreased by six-week load-free swimming training in spontaneously hypertensive rats（SHR）to further demonstrate the mechanism of hypertension improved by exercise.Methods：Sixteen male four-week old SHR and sixteen Wistar-Kyoto （WKY）rats were randomly divided into SHR exercise group，SHR rest group，WKY exercise group and WKY rest group.Rats in SHR exercise group and WKY exercise group exercised with a six-week load-free swimming protocol（1 hour per day，5 days per week）.The blood pressure of rat was tested by CODATM2 single non-invasive blood pressure measurement appliance.The samples were used to do the two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.Results：The blood pressure was decreased significantly after six-week load-free swimming.The six proteins were identified by mass spectrometry and data base retrieval.They are rCG45257，similar to ankyrin repeat domain 13 family，member D，chain A，rat Transthyretin，Ras association domain family 1 isoform A，fetuin B precursor and γ-actin.

six-week load-free swimming；hypertension；plasma proteomics；SHR

G 804.7

A

1005-0000（2010）05-0400-04

2010-06-07；

2010-09-06；錄用日期：2010-09-10

天津市高等學?？萍及l(fā)展基金項目（項目編號：20060201）

馮 紅（1971-），女，天津市人，副教授，博士，研究方向為運動生理學、細胞與分子生物學。