賴愛萍,陳文鶴

肥胖兒童少年內脂素RS4730153位點基因多態(tài)性與運動干預前、后糖代謝和脂代謝變化

賴愛萍1,2,陳文鶴1

目的:探討肥胖兒童少年內脂素RS4730153位點基因多態(tài)性及其與運動干預引起糖代謝和脂代謝變化的關系。方法:對88名年齡為144.11±3.63歲,BM I為29.26±4.44的漢族肥胖兒童少年(男40名,女48名)進行封閉式的4周中等強度有氧運動減肥,LDRPCR測序分型技術確定受試者內脂素RS4730153位點基因型,并在運動干預前后進行糖代謝和脂代謝指標的測定。結果:受試者A/G基因型出現頻率為15.9%,有氧運動前后各指標呈顯著性變化,不同基因型受試者運動前TG水平呈顯著性差異(分別為GG:1.40±0.74 mmol/L;AG:1.86±1.11mmol/L;P=0.050),運動引起的不同基因型受試者HOMA-β變化差異顯著(P=0.050)。結論:所測中國漢族肥胖兒童少年中存在內脂素單核苷酸多態(tài)性位點RS4730153變異,RS4730153純合子GG型可能可以通過降低TG水平、提高胰島素對運動干預的敏感性等方面參與肥胖兒童少年的糖代謝和脂代謝調節(jié)。

內脂素;基因多態(tài);肥胖兒童少年;糖代謝;脂代謝

1 前言

增加運動與活動,改善機體的適應能力是治療肥胖及其繼發(fā)病的一條安全有效的措施[3]。在運動干預肥胖人群的研究中,發(fā)現,同樣的運動干預對于不同肥胖人群的減肥效果卻不盡相同,其原因可能是由于人體在肥胖相關因子的基因水平上存在著差異所致[4]。Johansson L M等[13]、B?ttcher Y等[6]、Blakemore A I等[5]均發(fā)現內脂素基因多態(tài)性可能可以作為肥胖的內在易感因素,說明內脂素的基因多態(tài)性在一定程度上可能影響體內糖代謝、脂代謝和肥胖,決定了肥胖與糖代謝及脂代謝能否改變的先天易感性,但這一易感性是否可以像Plin基因等[1]一樣能通過運動加強或阻止,能否最終調節(jié)有氧運動對肥胖兒童少年減肥效應和程度,迄今為止未見報道。

目前,有關內脂素基因多態(tài)性與糖代謝和脂代謝關聯(lián)的研究主要集中于以下三個位點:啟動子-1001 T>G (RS9770242)、啟動子-948 G>T(RS59744560)及第6內含子RS4730153。其中對RS4730153位點與糖脂代謝關聯(lián)的報道不一。有研究[13]發(fā)現肥胖人群和健康對照人群之間該位點基因頻率或基因型頻率均無顯著性差異,且無論是哪組人群均未發(fā)現該位點與脂代謝指標有關聯(lián)。但另有報道[6]發(fā)現德國Ⅱ型糖尿病患者中該位點A/A基因型者內臟脂肪/皮下脂肪內脂素mRNA表達比例明顯低于其他基因型(P<0.05),提示該位點的基因多態(tài)與糖代謝、脂代謝似乎有某種關聯(lián)。相異結果的出現可能與種族、年齡、實驗條件等有關,在這些研究中均未對實驗條件、實驗對象狀況等缺乏嚴格控制和說明,而這些因素均有可能會影響研究結果的客觀性和可靠性。加上研究對象大多是成年人,而環(huán)境因素對既定的遺傳易感性的基因表型會有較大的影響,甚至可能會掩蓋復雜基因表型的影響?；诖?對兒童少年進行基因多態(tài)性的研究應是更有意義的,因為相對于成年人而言,兒童少年的基因表型很少受并發(fā)癥、治療等其他混雜因素的影響。

因此,本研究將以中國漢族肥胖兒童少年為對象,通過連接酶檢測-聚合酶鏈式反應(LDR-PCR)測序分型技術研究內脂素RS4730153位點基因多態(tài)性與糖代謝、脂代謝水平的關聯(lián)以及對運動減肥干預效果的影響。

2 研究對象與方法

2.1 研究對象

參加2008年上海暑期封閉運動減肥夏令營的肥胖兒童少年88名,入營前除了參加各自校內規(guī)定的體育課以外均無額外的體育鍛煉,年齡14.11±3.63歲,BM I 29.26 ±4.44,均為華東地區(qū)漢族人,其中男性40名,年齡13.21 ±3.01歲,女性48名,年齡14.88±3.96歲。入營前均接受專業(yè)醫(yī)生體格檢查和病史問詢,確定無遺傳病史,無吸煙史,無心血管、肝臟、腎臟、肺等疾病史,未曾使用減肥藥物。運動減肥過程中除了一例(女性)中途退營以外,其他營員均堅持到4周運動減肥結束。本研究過程經上海體育學院倫理委員會批準,獲受試者本人及家長同意并簽署書面同意書。

2.2 研究方法

為保證受試者的正常生長發(fā)育,入營后每位營員的飲食均由專業(yè)營養(yǎng)人士根據各自實際情況和兒童少年發(fā)育特點進行配餐和分餐,熱能供給比例約為糖∶脂肪∶蛋白質=60%～70%∶10%～15%∶20%～25%,每天用鹽< 6 g,保證營養(yǎng)素供能的均衡合理,熱能的充足攝入以及食物來源的多樣化并進行每周定期的健康教育。營員進行兩天飲食適應期后作基因多態(tài)性測定,同時作有氧運動前空腹血檢,并于4周有氧運動結束后再次進行空腹血檢,第二次的測試安排在有氧運動結束后的第二天清晨(約距前一天運動結束18～20 h),以此避免急性運動的影響。

2.2.1 運動處方

為制定合理的運動處方,每位受試者均先進行遞增運動負荷試驗:安靜心電圖描記后受試者在平板跑臺進行4 km/h,6 km/h和8 km/h 3個遞增定量負荷的運動試驗,每級負荷持續(xù)2 min后,描記負荷后即刻心電圖。若心電圖出現明顯異常、或心率超過最大心率的80%、或受試者主觀無法繼續(xù)堅持試驗時終止試驗。運動負荷試驗結束后描記運動后1 min的恢復心電圖,在此基礎上由運動專家開設個人運動處方。入營后按此運動處方進行為期4周的有氧運動,運動強度確定為中等強度有氧運動,因為中等強度有氧運動比高強度更有效的減肥[16]。運動頻率為每周六天,包括晨練,每天2次,運動時間持續(xù)為4周。每次運動時間為120 min(上午:10:00—12:00;下午:15: 00—17:00),包括準備活動、正式運動、整理活動。運動形式選擇強度易控制且簡單易學的方式如球類、游泳、健身操等。POLAR表用于監(jiān)測運動中心率并由運動人體科學本科以上學歷者進行全程運動強度跟蹤監(jiān)控,專業(yè)醫(yī)務人員作運動醫(yī)務監(jiān)督。

2.2.2 血液指標檢測

4周有氧運動前后營員分別進行兩次靜脈取血,均為清晨空腹狀態(tài)。取血后分別測血脂六項、糖化血紅蛋白、胰島素及血糖,余0.2 ml抗凝血用于內脂素基因多態(tài)性測定。空腹血糖(FPG)用葡萄糖氧化酶法、總膽固醇(TC)用酶反應法、甘油三酯(TG)用乙酰丙酮微量測定法、低密度脂蛋白(LDL-C)用聚乙烯硫酸沉淀法、高密度脂蛋白(HDL-C)用磷鎢酸鎂測定法。空腹胰島素(FINS)用放射免疫分析法,采用胰島素敏感性指數[2]ISI=1/FPG×Fins和穩(wěn)態(tài)模型評估法胰島素抵抗指數HOMA-IR=FPG× FINS/22.5[10]評價胰島素敏感性,采用穩(wěn)態(tài)模型評估法胰島β細胞功能指數HOMA-β=20×FINS/(FPG-3.5)[10]作為基礎狀態(tài)下的胰島素分泌指標。

2.2.3 內脂素基因多態(tài)性檢測

采用連接酶檢測-聚合酶鏈式反應(LDR-PCR)測序分型技術,樣本處理后采用AXYGEN公司的AxyPrep-96全血基因組DNA試劑盒進行總DNA抽提。引物如下:Forward 5’TCCCCCAAGCTGTTATGGTA 3’;

Reverse 5’AAGGTATGGTTGACCCAGCTA 3’,長度200 bp。根據引物和探針的分子量加TE稀釋至50 pmol/ μl做為母液,PCR反應體系20μL,3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,觀察PCR產物的效果,確定其作為模板在LDR反應中加入的量。LDR10μl,參數為95℃2 min→94℃30s→50℃2 min。ABI PRISM 377 DNA Sequencer上做測序電泳,應用Genemapper軟件進行數據分析和基因分型。

2.3 統(tǒng)計學分析

所有數據均在SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包里完成,所測數據用均數±標準差±S)表示。運用χ2檢驗計算受試人群的基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律,顯著性水平為P<0.05。運動干預前后比較采用配對t檢驗,不同基因型人群之間運動前后糖代謝和脂代謝比較用獨立樣本t檢驗,進一步分析用協(xié)方差分析(ANCOVA),不同性別不同基因型分組后各指標比較用方差分析(ANOVA)。所有的統(tǒng)計檢驗均采用雙側檢驗,顯著性水平為P≤0.05,非常顯著性水平為P≤0.01。

3 結果

3.1 RS4730153位點基因分型

圖1 內脂素RS4730153位點分型截圖Figure 1 Screenshots of Visfatin RS4730153 genotypes

聚丙烯酰胺凝膠測序電泳結果顯示,88位受試者出現14例A/G基因分型(其中男性8名,女性6名),頻率為15.9%,其余受試者均為G/G基因分型,頻率為84.1%。等位基因A,G頻率為8%,92%。經χ2檢驗可知,所測的88名漢族肥胖兒童少年內脂素RS4730153多態(tài)位點的基因型分布符合H-W平衡(χ2=1.037,df=2,P=0.595)。

3.2 運動干預前后受試者檢測指標變化

表1 受試者運動干預前后各指標變化一覽表Table 1 Changes in Indexes before and after the Exercise Intervention

可見,各指標均在運動干預前后呈非常顯著性變化(P<0.01)。

3.3 RS4730153不同基因型受試者各指標運動前后比較

可知,不同基因型受試者運動前TG水平呈顯著性差異(P=0.05),以運動前BM I作協(xié)方差進行協(xié)方差分析,發(fā)現差異仍存在(P=0.043,未在表中顯示)。受試者運動后不同基因型間FINS和HOMA-β存在顯著性差異,分別以運動前FINS和HOMA-β作協(xié)方差進行協(xié)方差分析,發(fā)現運動后不同基因型間FINS的差異性消失(P=0.064,未在表中顯示),而運動后不同基因型間HOMA-β仍存在顯著性差異(P=0.050,未在表中顯示)。

表2 運動干預前后RS4730153不同基因型受試者之間各指標比較一覽表Table 2 Comparing in Indexes before and after the Exercise Intervention with Different RS4730153 Genotypes

3.4 運動前后不同基因型受試者間各指標的性別差異

將人群可分為四組:男性GG組(1)32人、男性AG組 (2)8人、女性GG組(3)42人、女性AG組(4)6人。用ANOVA比較四組運動前后各項指標的差異(表3)。

表3 運動前后各組間有差異的指標列一覽表Table 3 List of the Indexes Changing Significently before and after the Exercise Intervention

以運動前HDL/LDL進行協(xié)方差分析,發(fā)現運動后HDL/LDL的組間差異仍存在。但以運動前FINS對運動后FINS作協(xié)方差分析,發(fā)現組間差異消失(未在表中顯示)。

4 討論

自2005年Fukuhara等[9]分離出內脂素后,對肥胖及與之相關的胰島素抵抗人群的內脂素水平及基因表達時有報道,提示內脂素基因變異可能也與肥胖的發(fā)展有關。人類該基因位于染色體7q22.1和7q31.33之間,分子量為52kDa,編碼491個氨基酸[12](National Center for Biotechnology Info rmation accession number AAA 17884)。包含11個外顯子與10個內含子,所有的外顯子/內含子剪接點均符合AG/GT規(guī)律。

肥胖者血清內脂素濃度與HDL-C負相關,與血清TG正相關[11]。這可能反映了胰島素抵抗和代謝綜合癥患者胰島素敏感性的不同所導致的脂代謝紊亂,即:TG升高而HDL降低。本研究發(fā)現在中國漢族肥胖兒童少年人群中,內脂素RS4730153位點不同基因分型組間TG水平有明顯差異(GG:1.40±0.74 mmol/L;AG:1.86±1.11 mmol/L;P=0.050),提示RS4730153AA型可能與降低脂代謝紊亂的風險有關。雖然GG型HDL有上升的趨勢,但差異不呈顯著性(P=0.245),這與國外有關RS4730153位點基因多態(tài)性的兩篇研究不同[13,15],在Johansson[13]關于瑞典肥胖成人和Korner等[15]關于德國肥胖兒童所作的研究中均未發(fā)現RS4730153位點與脂代謝指標有任何關聯(lián),出現不同的結果可能是種族差異所致。此外,基因檢測方法的不同也可能是造成差異的原因之一。本研究首次發(fā)現RS4730153基因多態(tài)性與TG水平相關,證實了該位點基因多態(tài)性參與了脂代謝的調節(jié)。此外,本研究中RS4730153位點的不同基因組間基礎胰島素水平、血糖水平及形態(tài)指標均無顯著性差異,這與以往研究相似。

運動能影響內脂素水平,這點在人體實驗[7,8]和動物實驗[14]中均得到驗證,但人體研究中基本沒有控制飲食的影響,也沒有提供讓人信服的證據來證明內脂素的變化到底是因為由運動引起還是由體重降低引起的。本研究在保證合理的飲食供給并給予兩天的飲食適應期后,發(fā)現4周的有氧運動干預能有效地降低了TG、TC及LDL水平,出現了良好的效應。實驗中HDL水平在運動后也顯著下降,這可能是與本實驗的被試入營前均為靜態(tài)生活人群有關,但是HDL/LDL比例在運動后顯著上升,表明有氧運動干預對受試者脂代謝有良好影響。此外,糖代謝指標FPG、FINS等在運動后均顯著性下降(P<0.01),說明本次干預是非常有效的。

本研究結果顯示,運動后不同基因型人群間Insulin和HOMA-β均存在組間差異,為排除運動前該二項指標的影響,分別以運動前Insulin和HOMA-β作協(xié)方差分析受試者運動后不同基因型間Insulin和HOMA-β的差異性,發(fā)現Insulin組間差異消失,說明運動后不同基因型間Insulin的差異性是由運動前Insulin水平不同引起。而HOMA-β仍存在組間差異性,說明不同基因型受試者HOMA-β對運動的敏感性不同,RS4730153GG型可能是運動敏感基因型。

值得注意的是,本研究中HOMA-β在運動后顯著下降,這似乎與以往研究得出的運動能提高胰島素β細胞功能的論點相左。然而,受試者糖代謝水平的變化并不能將該指標獨立出來討論,HOMA-β=20×FINS/(FPG-3.5),結合本研究中FINS和FPG兩種指標的變化可看出,受試者運動后血糖的降低遠低于胰島素值的降低,這必然會造成由此公式計算出的HOMA-β的變化運動前后的差異性。胰島素分泌水平受胰島素抵抗和β細胞功能的雙重影響,輕度胰島素抵抗即可引起較大幅度胰島素分泌以維持血糖不升高或僅輕度升高。如糖耐量受損者常有胰島素抵抗,胰島素水平高于正常糖耐量者較多,血糖僅輕度升高,其20×FINS/(FPG-3.5)值高于后者是預料之中的,但這種影響卻掩蓋了該人群以這些比值評估的β細胞功能受損程度,因此會出現“糖耐量受損者β細胞功能好于正常糖耐量者”的怪現象。本研究中出現的運動后HOMA-β值的顯著性降低,反而印證了運動對受試者胰島素值的降低,說明運動對胰島素敏感性的有效改善。而運動后HOMA-β值在不同基因型之間的差異,與上文提到的不同基因型之間胰島素水平變化的差異相結合,提示了GG型可能是糖代謝的運動敏感性基因。同時提示今后在應用這一公式評估β細胞功能時必須調整胰島素抵抗的影響,不如此會得出錯誤結果。

此外,本研究中發(fā)現,性別因素對不同基因型人群運動前后糖代謝和脂代謝指標有影響。但由于樣本量的限制,本研究中男性女性AG人數僅分別出現8例和6例,今后的研究還需收集更多樣本,以對該位點基因多態(tài)性與運動干預效果及性別差異的關系作出更明確更深入的研究。

5 結論

所測中國漢族肥胖兒童少年中存在內脂素單核苷酸多態(tài)性位點RS4730153變異,RS4730153基因多態(tài)性與肥胖人群糖代謝和脂代謝紊亂及運動減肥干預效果有關。純合子GG型可能可以通過降低TG水平、提高胰島素對運動干預的敏感性等方面參與肥胖兒童少年的糖代謝和脂代謝調節(jié)。

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Single Nucleotide Polymorphisms of RS4730153 in Visfatin Gene and Its Relation to the Exercise-induced Glucose and L ipid Metabolism Changes in Obese Children and Adolescents

LA IA i-ping1,2,CHEN Wen-he1

Objective:To investigate the single nucleotide polymorphisms(SNPs)of RS4730153 in visfatin gene in obese children and adolescents of Han nationality,and analyze its relation to the exercise-induced glucose and lipid metabolism changes.Methods:88 obese children and adolescents(male=40,female=48;age=14.11±3.63;BM I=29.26±4.44)of Han nationality comp leted a 4-week aerobic exercise p rogram to lose weight,and their distribution of genotype was got by using ligase detection-polymerase chain reaction(LDR-PCR).Meanw hile, the indexes of glucose and lipid metabolism befo re and after exercise intervention were determined.Results:The frequency of the visfatin A/G genotype was 15.9%.The indexes of glucose and lipid metabolism befo re and after aerobic exercise showed significant changes.TG levels befo re exercise was significantly different between the different genotypes subjects(GG: 1.40±0.74mmol/L,AG:1.86±1.11mmol/L,respectively,P=0.050).HOMA-βafter exercise was significantly different between the different genotypes subjects(GG:220.50± 178.81,AG:332.23±207.90,respectively,P=0.050).Conclusion:The SNPs of visfatin RS4730153 variation was found in obesity children and adolescents from Chinese Han nationality.Homozygous GG was possibly involved in glucose and lipid metabolism by reducing TG levels and imp roving exercise-induced insulin sensitivity.

visfatin;sing le nucleotide polymorphisms(SN Ps);obese children and adolescents;g lucose and lipid metabolism

G804.7

A

1000-677X(2010)08-0057-05

2010-06-21;

2010-07-28

國家科技支撐計劃項目(2006BAK33B04-2);上海市第三期運動人體科學重點學科開放基金課題(S30902)。

賴愛萍(1974-),女,浙江建德人,副教授,在讀博士研究生,研究方向為運動生理學,Tel:(0571)89932521,E-mail: lap810@163.com;陳文鶴(1947-),男,上海人,教授,博士研究生導師,研究方向為運動生理學,Tel:(021) 51253250,E-mail:wenhechen@126.com。

1.上海體育學院運動科學學院,上海200438;2.浙江體育職業(yè)技術學院體育系,浙江杭州310012 1.Shanghai University of Sport,Shanghai 200438,China; 2.Physical Education Department of Zhejiang College of Sports,Hangzhou 310012,China.