王琴丹，李柏林，歐 杰，羅 璟，嚴維凌，陳 平

(1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海市食品研究所，上海 200235)

中式熟食咸雞主要細菌的分離與初步鑒定

王琴丹1，李柏林1，歐 杰1，羅 璟1，嚴維凌2,*，陳 平2

(1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海市食品研究所，上海 200235)

采用嗜冷菌選擇性培養(yǎng)基和含鹽選擇性培養(yǎng)基對咸雞微生物菌群進行分離篩選。根據(jù)細菌的菌落形態(tài)、革蘭氏染色反應等常見特征，由嗜冷菌選擇性培養(yǎng)基分離出6株菌C1～C6，含鹽選擇性培養(yǎng)基分離出4株NaCl脅迫條件下細菌S1～S4。提取單菌落DNA，對其16S rDNA序列進行PCR擴增后測序，結合形態(tài)、常規(guī)生理生化特性初步鑒定為：松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)C3，土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)C6，不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)C1、C2、C4、C5；日勾維腸桿菌(Enterobacter gergoviae)S1，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)S2、S3，假蕈狀芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides)S4。

咸雞；耐冷菌；NaCl 脅迫；分離；鑒定

Abstract ：Based on morphological identification and gram staining, 6 microbe strains, numbered C1 through C6, were isolated from Chinese-style cooked salted chicken using Psychrophiles selective medium and the use of nutrient agar medium containing 3% NaCl allowed isolation of 4 microbe strains, numbered S1 through S4. Single colonies were separated for 16S rDNA gene amplification and sequencing. Based on the results of morphological, physiological and biochemical studies, strain C3 was identified as Staphylococcus sciuri, C6 as Klebsiella terrigena, C1, C2, C4 and C5 as Acinetobacter sp, S1 as Enterobacter gergoviae,S2 and S3 as Staphylococcus epidermidis, and S4 as Bacillus pseudomycoides.

Key words：salted chicken；Psychrotrophs；salt stress；screening；identification

低溫微生物是引起冷藏、冷凍食品變質(zhì)的主要微生物，可分為嗜冷菌和耐冷菌兩大類[1]。盡管低溫微生物的發(fā)現(xiàn)距今已有100多年，由于實驗條件的限制，相對中溫微生物而言其研究還不夠廣泛和深入[2]。國外學者對嗜冷菌的研究開始較早，涉及食品、環(huán)境等多個方面[3-5]；我國亦有檢測牛奶或奶粉中嗜冷菌的相關報道[6]；但對傳統(tǒng)熟食，如咸雞中低溫微生物的研究卻鮮有報道。Kushner[7]將鹽生微生物分為6類，耐鹽菌生長對氯化鈉沒有要求。早在上個世紀，Lefevre等[8]就開始了對嗜鹽菌的研究，對中度嗜鹽菌的研究較多[9]。國內(nèi)外學者主要用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法研究西式火腿、熏肉、燒烤等的致病菌，未能從分子生物學的角度進行分析，且關于中式傳統(tǒng)熟食的嗜鹽菌報道較少。咸雞由于含鹽量較高，形成了良好的耐鹽菌生境，但可能由于嗜鹽菌的存在不利于咸雞的保鮮。

本研究利用分子生物學與純培養(yǎng)的方法，對中式熟肉中主要微生物基因型和表現(xiàn)型兩方面進行鑒定，了解特殊環(huán)境下細菌生長的相關特性，從而為熟肉產(chǎn)品生產(chǎn)設備的開發(fā)、生產(chǎn)工藝規(guī)范化、質(zhì)量標準化提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 咸雞樣品采集

咸雞由上海某公司生產(chǎn)，為雞齡1年的淘汰雞，每只質(zhì)量約1kg，腌漬24h后鹽水煮沸40min，撈出冷卻后獨立包裝。咸雞進一步分割和套聚乙烯(PE)包裝，包裝質(zhì)量250g。置于5℃、相對濕度50%的恒溫恒濕箱中貯藏，定時取樣(均勻剪取雞胸和雞腿的表皮和肉、混合，并做3個平行)。

1.2 試劑與儀器

嗜冷菌選擇性培養(yǎng)基用于低溫微生物的分離和培養(yǎng)，由北京路橋技術有限責任公司提供；普通營養(yǎng)瓊脂添加質(zhì)量分數(shù)3.0% NaCl(每100g營養(yǎng)瓊脂)，使之接近咸雞的鹽度，用于NaCl脅迫條件下細菌的分離和培養(yǎng)，由上海疾病預防控制中心提供；生理生化實驗試劑由杭州天和有限公司提供。

PCR擴增試劑及擴增引物 上海生工生物工程技術服務有限公司；BSC12S1 Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒 Biospin公司；AG 22331 Hamburg普通PCR儀德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 咸雞樣品理化分析

水分含量：采用GB/T 9695.15—2008《肉與肉制品水分含量的測定》[10]；水分活度：采用GB/T 23490—2009《食品水分活度的測定》[11]；氯化鈉含量：采用GB/T 9695.8—2008《肉與肉制品氯化鈉含量測定》[12]；pH值：采用GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品pH測定》[13]。

1.3.2 菌種培養(yǎng)與分離

樣品經(jīng)系列稀釋后涂布在嗜冷菌選擇性培養(yǎng)基上，于(7±1)℃培養(yǎng)，7～10d后菌落計數(shù)[14]。挑取菌落表型差異的單菌落，純化后將適于低溫下生長的分離菌種轉(zhuǎn)至嗜冷菌選擇性培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)7d后于4℃保存。

樣品經(jīng)系列稀釋后涂布在自制含鹽選擇性培養(yǎng)基上，于(37±1)℃培養(yǎng)，2d后菌落計數(shù)。挑取菌落表型差異的單菌落，純化后將適于低溫、3.0% NaCl脅迫下能夠生長的分離菌種轉(zhuǎn)至含鹽選擇性培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)2d后4℃保存。

1.3.3 單菌落DNA提取及16S rDNA的PCR擴增[15]

選用Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒直接提取單菌落DNA。以提取的基因組DNA為模板，選用細菌通用引物正向引物27f，反向引物1492r，選用25μL體系進行聚合酶鏈式PCR反應。

1.3.4 測序及比對

選擇上海生工生物工程技術服務有限公司DNA柱式抽提試劑盒進行PCR產(chǎn)物的純化，并由該公司進行測序。將該序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行比對(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

1.3.5 咸雞樣品生理生化鑒定

參照東秀珠等[16]的《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》。

2 結果與分析

2.1 咸雞樣品理化分析

表1 咸雞的理化性質(zhì)Table 1 Physico-chemical properties of salted chicken breast and leg meat

2.2 嗜冷菌在5℃條件下的生長情況

前7d每8h定時取樣，之后每6h定時取樣進行菌落計數(shù)。5℃生長情況為細菌的培養(yǎng)時間提供了參考數(shù)據(jù)。實驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)到第7天時兩種菌都達到了對數(shù)期，因此確定嗜冷菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌的時間為7d。

圖1 5℃條件下咸雞細菌生長情況Fig.1 Growth curve of bacteria from salted chicken at 5 ℃ without the presence of NaCl

圖2 5℃、3% NaCl脅迫條件下咸雞細菌生長情況Fig.2 Growth curve of bacteria from salted chicken at 5℃ with the presence of NaCl

2.3 單菌落DNA的提取

圖3 菌株的總DNA電泳圖譜Fig.3 Electrophoretic analysis of total DNA from strains C1 through C6 and S1 through S4

將從活菌中提取的總DNA進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，在23kb左右出現(xiàn)條帶(圖3)，表明已獲得較為完整的微生物的全部基因組的DNA。

2.4 菌株的16S rDNA基因序列

對10株活化菌進行16S全長序列的PCR擴增，均能得到重復性好且穩(wěn)定、清晰的特異條帶，片段大約1500bp 左右(圖 4)。

圖4 菌株的16S rDNA電泳圖譜Fig.4 Electrophoretic analysis of PCR amplification products of the 16S rDNA gene fragments from strains C1 through C6 and S1 through S4

2.5 測序及比對

表2 主要分離細菌常見生理生化鑒定Table 2 Morphological properties of strains C1 through C6 and S1 through S4

參照GenBank比對的結果，根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》作相應的生理生化實驗(表2)，可得C3為葡萄球菌屬(Staphylococcus sp.)的松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)，C6為克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)的土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)，C1、C2、C4、C5為不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)。S1為腸桿菌屬(Enterobacter sp.)的日勾維腸桿菌(Enterobacter gergoviae)，S2、S3為葡萄球菌屬(Staphylococcus sp.)的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，S4為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)的假蕈狀芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides)。其中，由于不動桿菌生理生化鑒定涉及許多氨基酸實驗，許多表型陽性反應不明顯，且含有多個未命名的新種，本研究未能將其確定到種。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

將10株分離細菌所獲得的16S rDNA序列提交NCBI，獲得它們在GenBank數(shù)據(jù)庫中的臨時登錄號C1～C6為：GQ899177～GQ899182，S1～S4為：GQ890463、GQ890464、GQ866975和GQ899176。通過Blast軟件與GenBank中已發(fā)表的16S rDNA序列進行同源性比較，選取同源性在99%以上的細菌構建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖5可知，C1、C2、C4、C5與不同桿菌屬Acinetobacter sp.(EU236748)親緣關系最近；C3與葡萄球菌Staphylococcus sciuri(AB233331)的親緣關系最近；S1與腸桿菌屬Enterobacter sp.12(EU884439)的親緣關系最近；S2、S3分別與葡萄球菌屬Staphylococcus vitulinus(AM062694)和Staphylococcus carnosus strain 1708 (FJ795527)的親緣關系最近；S4與芽孢桿菌屬Bacillus cereus strain Y3(GQ462534)的親緣關系最近。

圖5 基于16S rDNA序列同源性的10株細菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strains C1 through C6 and S1 through S4 based on the 16S rDNA sequences

2.7 細菌菌落特征

由表3可知，細菌特征觀察結果與測序結果所對應的細菌一致，結合16S rDNA基因序列這一有效分子指標進行細菌分類的初步鑒定，可得到細菌所在的種。

3 討 論

3.1 中式散裝熟食的檢測主要圍繞菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌(沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、致瀉大腸埃希氏菌、副溶血性弧菌)[17-18]進行，對一些特殊腐敗菌的分析較少。分離純化工作量大，時間長，對部分細菌的分類鑒定仍困難重重，而且只有不到1%的微生物是可以在實驗室條件下培養(yǎng)的，絕大部分的微生物在目前條件下還未能培養(yǎng)[19-20]，因此對散裝熟食的微生物污染狀況了解的不夠全面和透徹。

3.2 實驗中未發(fā)現(xiàn)致病菌，分離出的10株活菌不排除屬于同一個屬，如C1、C2、C4、C5同屬于不動桿菌屬。有的鑒定為同一個種的菌株表型有可能不同，如S2、S3雖然鑒定結果都是表皮葡萄球菌，但S2的OF表型為陽性、S3為陰性；葡萄糖S2為陰性，而S3為陽性?？赡芘c其比較特殊的生長環(huán)境有關，也有可能是某種尚未被發(fā)現(xiàn)的新種或亞種，有待進一步研究。

3.3 參照《伯杰細菌手冊》[21]，葡萄球菌生長溫度范圍6.5～46℃，因此在7℃的培養(yǎng)溫度下，仍能較好的生長；不動桿菌屬和克雷伯氏菌屬生長的最適溫度范圍分別為30～32℃和35～37℃，在7℃能夠生長，可認為是耐冷菌或兼性嗜冷菌[2]。大部分細菌的最低水分活度值范圍是0.90～0.99，嗜鹽性細菌最低可達0.75，咸雞的水分活度高達0.963，能夠滿足嗜鹽菌生長要求；芽孢桿菌和腸桿菌的pH值適應范圍都較廣，pH6.3在其最佳pH值范圍內(nèi)，且兩者的耐鹽度較高，因而生長狀況良好。嗜冷和含鹽選擇性培養(yǎng)基都分離得到了葡萄球菌，這與葡萄球菌屬生長溫度、pH值和耐鹽范圍廣是一致的，與孫承峰等[22]在低溫醬牛肉中分離得到葡萄球菌、腸桿菌等主要腐敗菌的結果一致。

葡萄球菌、不動桿菌和克雷伯氏菌通常存在于食品、塵埃、土壤和水中，分布較廣泛[21]。咸雞經(jīng)過蒸煮之后沒有二次殺菌工藝，因此在冷卻和包裝的過程中可能污染上這些細菌。腸桿菌屬在需氧生長中會產(chǎn)生過氧化氫，由于過氧化氫酶在熟制中被鈍化，因而一些耐熱的腸桿菌也能存活下來。另外，由于咸雞中未添加亞硝酸鹽等防腐劑抑制殘存的細菌而可能造成食物的腐敗，與南慶賢等[23]曾得到相同的結論。

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Screening and Preliminary Identification of Dominant Bacteria in Chinese-style Cooked Salted Chicken

WANG Qin-dan1，LI Bai-lin1，OU Jie1，LUO Jing1，YAN Wei-ling2,*，CHEN Ping2
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2. Shanghai Food Research Institute, Shanghai 200235, China)

TS201.3；TS251.6

A

1002-6630(2010)15-0212-04

2009-12-31

上海市科委應用技術專項資金開發(fā)項目(08-121)

王琴丹(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：wangqindan2005@163.com

*通信作者：嚴維凌(1967—)，男，高級工程師，本科，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：yanwling@hotmail.com