劉 偉，徐 濤，蔡敬民,*，潘仁瑞，吳 纓

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，安徽 合肥 230036；2.合肥學院生物與環(huán)境工程系，安徽 合肥 230022；3.合肥學院化學與材料工程系，安徽 合肥 230022)

海洋小鏈霉菌DY2741抗菌物質(zhì)的溶解性質(zhì)及分離純化

劉 偉1,2，徐 濤2，蔡敬民1,2,*，潘仁瑞2，吳 纓3

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，安徽 合肥 230036；2.合肥學院生物與環(huán)境工程系，安徽 合肥 230022；3.合肥學院化學與材料工程系，安徽 合肥 230022)

在拮抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌活性的指示下將一株海洋小鏈霉菌DY2741的代謝產(chǎn)物分離純化。通過對該菌發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)的溶解性質(zhì)測定，可推知該物質(zhì)極性中等。Sephadex LH-20柱色譜分離后，經(jīng)抗菌活性檢測發(fā)現(xiàn)兩個活性峰，其中第2個峰的抑菌活性較強。將第2個峰的洗脫液各組分進行薄層色譜分析，選取斑點清晰且單一的組分進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，總離子流圖表明該組分成分單一，根據(jù)質(zhì)譜圖譜與標準譜庫比對以及紅外光譜分析，初步判斷該組分為鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)。該成分為小鏈霉菌DY2741的主要抗菌物質(zhì)之一。

海洋小鏈霉菌；抗菌物質(zhì)；溶解性質(zhì)；分離純化

Abstract：One aliquot of the fermentation supernatant of Streptomyces parvus DY2741 using soybean powder as substrate was vacuum dried and the residue was extracted with water or 5 different organic solvent alone. The ethyl acetate extract was found to have good inhibitory activity against both S. aureus and E. coli. Another aliquot of the fermentation supernatant was directly extracted with ethyl acetate 3 times and the extracts were then pooled and condensed in a rotation evaporator and blown to dryness under nitrogen. Finally, the residue was dissolved in methanol and filtrated before purification/fractionization on Sephadex LH-20 column. As a result, two antibacterial fractions were obtained and the second eluting peak presented stronger inhibitory activities against both bacterial species. Thin layer chromatography was used to further fractionize the fraction with higher antibacterial activity. The subfaraction displaying a clear single spot was demonstrated by gas chromatography-mass spectrometry to contain a single composition, which was preliminarily identified to be dibutyl phthalate (DBP) based on searching Wiley Registry of Mass Spectral Data and infrared spectral analysis. Therefore, DBP is one of the major antibacterial substances produced by Streptomyces parvus DY2741.

Key words：marine Streptomyces parvus；antibacterial substance；solubility；separation and purification

海洋巨大的資源庫意味著巨大的財富，因此在20世紀90年代引起各國學者研究熱潮。海洋環(huán)境的獨特性和極端性特點，所發(fā)現(xiàn)的抗生素往往是新穎的，可能具有很好的應用前景。國內(nèi)很早就使用海洋生物治療疾病，但從海洋微生物中尋找抗菌物質(zhì)的研究則起步較晚，黃維真等[1]在福建鼓浪嶼沿海的海泥中分離到一株海洋放線菌——魯特格鏈霉菌鼓浪嶼亞種(Str. rutgersensis subsp. gulangyunensis)，它產(chǎn)生廣譜、低毒性的抗生物質(zhì)(minobiosamine)和肌醇胺霉素等，對綠膿桿菌和一些耐藥性革蘭氏陰性菌具有較強的抗性。王書錦等[2]在黃、渤海、遼寧近海地區(qū)采樣，分離到5608株海洋細菌，測定表明，約有25%的菌株具有不同程度的抗病原真菌、病原細菌的能力。劉全永等[3]從海洋細菌LUB02中分離到廣譜抗真菌活性物質(zhì)，對人和動物條件病原菌白色念珠菌(Candida albicans)有較強的抑制作用。王瑩等[4]從東海溫州海域采樣，分離到195株海洋細菌，篩選出22株菌具有抗菌活性，并對其中抗菌活性較強的6株進行16S rDNA序列分析。近年來不斷有新發(fā)現(xiàn)的海洋微生物菌種及其產(chǎn)生新的抗菌物質(zhì)的報道[5-6]。

因此，從海洋中篩選產(chǎn)高效、新穎、低毒的抗菌活性物質(zhì)潛力巨大。本實驗室從廈門附近海域篩選到一株具有廣譜抗菌活性的小鏈霉菌。本實驗在研究其抗菌物質(zhì)溶解性質(zhì)的基礎上，采用Sephadex LH-20柱色譜進行分離、純化，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和紅外光譜研究其成分。為進一步研究和確定小鏈霉菌DY2741的代謝產(chǎn)物提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

小鏈霉菌DY2741自廈門大嶼島海域潮間帶海洋軟體動物中分離?？咕钚詸z測指示菌株：革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌(S.aureus)、革蘭氏陰性菌大腸桿菌(E.coli)來源于合肥學院生物與環(huán)境工程系菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

菌株DY2741培養(yǎng)用培養(yǎng)基：1)菌株斜面培養(yǎng)保存培養(yǎng)基：高氏合成Ⅰ號培養(yǎng)基[7]；2)菌種種子培養(yǎng)基：葡萄糖酵母粉培養(yǎng)基[7]；3)菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆粉培養(yǎng)基[8]。鏈霉菌DY2741所用培養(yǎng)基均為人工海水配制，所有培養(yǎng)基均于121℃滅菌20min。指示菌培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[7]。

1.3 儀器與設備

QP5050氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；Nicolet 8700傅里葉紅外光譜儀 美國熱電儀器公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海青浦滬西儀器廠；NAS-12氮吹儀 合肥艾本森科學儀器有限公司；SP-752紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.4 菌種DY2741發(fā)酵液的制備

將小鏈霉菌DY2741接種于高氏Ⅰ號合成培養(yǎng)基斜面上，28℃培養(yǎng)7d。取新鮮培養(yǎng)的DY2741斜面用10mL無菌水洗下孢子，振蕩，制成菌懸液。將菌懸液按體積分數(shù)10%的接種量接種于種子培養(yǎng)基中，于28℃、180r/min培養(yǎng)3d。然后按體積分數(shù)5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、180r/min培養(yǎng)5d。收集發(fā)酵液，5000r/min離心15min，丟棄菌體，留上清。

1.5 指示菌平板的制備

將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)24h。取新鮮培養(yǎng)的指示菌斜面用0.85g/100mL的生理鹽水洗下，并將其稀釋成109個/mL的菌懸液(波長650nm，控制透光率為20%)。取5mL經(jīng)調(diào)整到達合適濃度的指示菌菌懸液，同100mL冷卻至60℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基充分混合，傾注于平皿中。

1.6 抗菌物質(zhì)在不同溶劑中的溶解性測定

取發(fā)酵上清液，每份10mL，經(jīng)真空冷凍干燥成粉后，分別加入無菌水、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚各1mL萃取過夜，以各個純?nèi)軇閷φ铡２捎霉艿╗9]以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌進行萃取液的抑菌活性測定。測量抑菌圈直徑并記錄抑菌結(jié)果，所有實驗重復3次。

1.7 不同pH值下不同萃取劑的萃取實驗

取發(fā)酵上清液，每份10mL，分別調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加入等量的乙酸乙酯，充分混勻，靜置萃取過夜。采用管碟法以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌分別檢測有機相和下層水相(pH值調(diào)回7.0)的抑菌活性，設純?nèi)軇閷φ战M。測量抑菌圈直徑并記錄抑菌結(jié)果，所有實驗重復3次。

1.8 發(fā)酵液的萃取實驗

取發(fā)酵液上清，調(diào)整pH值至7.0，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮、氮吹儀吹干，加入少量甲醇溶解后用0.22μm的尼龍微孔濾膜過濾備用。

1.9 Sephadex LH-20柱色譜分離

將經(jīng)萃取處理的濃縮液進行葡聚糖凝膠色譜分離，所用色譜分離介質(zhì)為Sephadex LH-20(2.6cm×100cm)，以體積分數(shù)1%上樣體積進行凝膠層析。1.5L洗脫液，其組成為甲醇與水體積比6:4，流速為1mL/min，每管收集7mL。通過薄層色譜法(TLC)分析，合并相同組分并減壓濃縮，凍干，適量甲醇溶解。采用管碟法以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌檢測洗脫液的抑菌活性，每個牛津杯中加入200μL洗脫液。測量抑菌圈直徑并記錄抑菌結(jié)果。

1.10 活性成分分析

薄層色譜分析：薄層板為Merck Silica gel 60 F254，展開劑為石油醚、乙酸乙酯、甲醇其體積比為3:1:0.5，紫外燈254、365nm波長處顯影和茴香醛染色觀察。

GC-MS分析：毛細管色譜柱型號為Rtx-5ms(30m×0.25mm，0.25μm)，柱溫升溫程序：初始升溫150℃，保持4min，以4℃/min升溫至250℃，保持10min[10]；進樣量：5μL，全掃描質(zhì)量范圍：m/z 40～400。樣品分析前經(jīng)0.22μm尼龍微孔濾膜過濾。

傅里葉紅外變換光譜分析：將1mg樣品加入到干燥的KBr晶體粉末中，壓片后再轉(zhuǎn)移至窗片中央直接測定。樣品測定前先用KBr晶體粉末做空白實驗測定，樣品實測的FTIR均需扣去空白峰，以消除空氣中水汽影響。分辨率：4cm-1，掃描次數(shù)：32次，增強因子：1.8，半峰寬：20.2cm-1。

1.11 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌物質(zhì)的溶解性測定

2.1.1 抗菌物質(zhì)在不同溶劑中的溶解性質(zhì)

發(fā)酵上清液凍干粉在不同溶劑中溶解后，通過萃取液對細菌的抑菌活性大小反映抗菌物質(zhì)在不同溶劑中的溶解性質(zhì)，結(jié)果見表1。

表1 抗菌物質(zhì)在不同溶劑中的溶解情況Table 1 Anti-S. aureus and E. coli activities of different solvent extracts of the freeze-dried residue of the fermentation supernatant of Streptomyces parvus DY2741

從表1可以看出，乙酸乙酯萃取液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑最大，其次是二氯甲烷、正丁醇，其他溶劑抑菌活性相對較低。由此可推知，該抗菌物質(zhì)可能是一種中等極性的脂溶性物質(zhì)。抗菌物質(zhì)在乙酸乙酯中的溶解性最好，也可溶于正丁醇、氯仿和甲醇，微溶于石油醚和水，抗菌物質(zhì)溶解性質(zhì)的研究結(jié)果為進一步分離純化提供了理論參考。

2.1.2 不同pH值條件下不同萃取物的抑菌效果

為了進一步分離純化小鏈霉菌DY2741的抗菌物質(zhì)，應研究其極性，因此對發(fā)酵液不同pH值條件下抗菌物質(zhì)的萃取效果進行研究。萃取劑與不同pH值的發(fā)酵上清液的體積比為1:1。萃取相(有機相)及水相的抑菌活性見表2。

從表2可以看出，在不同pH值條件下乙酸乙酯的水相均表現(xiàn)為抑菌圈為0mm，無抑菌活性；而有機相的抑菌圈大小與pH值存在相關(guān)性。在接近pH值中性條件下有機相的抑菌圈直徑最大。對照組(純?nèi)軇?均無抑菌活性。由此判斷該抗菌物質(zhì)極性中等。

2.2 Sephadex LH-20柱色譜分離組分的抑菌活性

為了分離純化經(jīng)乙酸乙酯萃取的粗提物，使用Sephadex LH-20柱色譜進行分離，共收集洗脫液182管。以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌檢測洗脫液的抑菌活性，結(jié)果見圖1。

圖1 Sephadex LH-20柱色譜分離后洗脫液的抑菌活性Fig.1 Anti-S. aureus and E. coli activities of each elution fraction of the ethyl acetate (at pH 7) extract of the fermentation supernatant of Streptomyces parvus DY2741 on Sephadex LH-20 column

由圖1可知，洗脫液經(jīng)檢測出現(xiàn)了兩個抑菌活性峰，B峰對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有明顯的抑菌活性，故選取此峰作進一步研究。

2.3 活性成分分析

對B峰中各組分進行薄層色譜(TLC)分析，其中89～97管樣品Rf=0.25，紫外、熒光顯影和茴香醛染色顯示其斑點單一且清晰，提示該樣品組分單一。

對89～97管樣品進行氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)分析，總離子流圖(TIC)為單一峰(圖2)；MS圖譜(圖3)與標準譜庫WILEY7(圖4)進行比對，該組分與鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)相似度達87%。

表2 在不同pH值條件下萃取物的抑菌活性Table 2 Anti-S. aureus and E. coli activities of lower and upper phases resulting from extraction of the fermentation supernatant of Streptomyces parvus DY2741 with ethyl acetate under varying pH conditions

89～97管樣品的紅外光譜分析如下：1706cm-1對應于C＝O的伸縮振動，1289cm-1和1136cm-1對應于C—O的伸縮振動，推測該化合物結(jié)構(gòu)中有酯鍵。3067cm-1對應于芳環(huán)上C—H的伸縮振動，1600cm-1處的組合峰對應于芳環(huán)上C—C的的伸縮振動，推測該化合物結(jié)構(gòu)中有苯環(huán)。2958cm-1對應于甲基(—CH3)的C—H伸縮振動，2930cm-1和2856cm-1對應于亞甲基(—CH2—)的C—H伸縮振動，1456cm-1對應于甲基(—CH3)不對稱變形振動或是亞甲基(—CH2—)對稱變形振動。綜上所述，該物質(zhì)紅外光譜具有明顯的芳香酯類特征。

圖2 89～97管樣品總離子流圖(TIC)Fig.2 Total ion chromatogram (TIC) of pooled fractions 89 through 97

圖4 標準譜庫中鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)質(zhì)譜圖Fig.4 Standard mass spectrum of DBP

El-Naggar[11]報道了鏈霉菌Streptomyces nasri submutant H35產(chǎn)生的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)具有抗菌活性。不久，Lee[12]報道鏈霉菌Str. melanosporofaciens也產(chǎn)DBP，證明它是葡萄糖苷酶的抑制劑。Roy等[10]研究表明鏈霉菌Str. albidoflavus產(chǎn)生的DBP對G+細菌G－細菌及單細胞的和絲狀真菌都有較強的活性；動物實驗未觀察到急性毒性。Foster等[13]報道DBP對SD大鼠的最小可見損害作用水平為66mg/(kg bw·d)。Mylchreest等[14]報道大劑量給藥(650mg/(kg bw·d))會導致繁殖力下降，減少精子數(shù)量和精子畸形。Watanuki等[15]報道DBP對吞噬細胞功能有調(diào)節(jié)作用。因此，DBP的藥理及毒理作用有待進一步研究。目前，未發(fā)現(xiàn)有小鏈霉菌產(chǎn)生DBP的報道。因此，其生物合成和藥物作用機理等方面值得進一步研究。

3 結(jié) 論

本實驗室自廈門海域采集的海洋軟體動物中分離得到一株小鏈霉菌DY2741，其發(fā)酵產(chǎn)物具有較強的抗菌活性，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌均有較好的抑菌效果。通過對其溶解性質(zhì)分析初步確定菌株DY2741的抗菌產(chǎn)物為中等極性抗菌物質(zhì)。Sephadex LH-20柱色譜將其分離，通過金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌檢測洗脫液的抑菌活性，出現(xiàn)兩個活性峰。其中B峰對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有較好的抑菌效果。通過對B峰的洗脫液各組分進行薄層色譜分析，選取斑點清晰且單一的89～97管樣品進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，總離子流圖表明該組分成分單一；根據(jù)質(zhì)譜圖譜與標準譜庫WILEY7對比及FTIR光譜分析，初步判斷該組分為鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)。

[1] 黃維真, 方金瑞, 蘇國成, 等. 福建沿海底棲放線菌及其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)[J]. 中國海洋藥物, 1991, 10(3): 1-6.

[2] 王書錦, 胡江春, 薛德林, 等. 中國黃海、渤海、遼寧近海地區(qū)海洋微生物資源的研究[J]. 錦州師范學院學報, 2001, 22(1): 1-5.

[3] 劉全永, 胡江春, 薛德林, 等. 海洋微生物生物活性物質(zhì)研究[J]. 應用生態(tài)學報, 2002, 13(7): 901-905.

[4] 王瑩, 吳根福. 東海海洋有抗菌活性細菌的篩選及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].農(nóng)機化研究, 2007(5): 34-38.

[5] CHO K W, LEE H S, RHO J R, et al. New lactone-containing metabolites from a marine-derived bacterium of the genus Streptomyces[J].Journal of Natural Products, 2001, 64(5): 664-667.

[6] MUKKU V J, SPEITLING M, LAATSCH H, et al. New butenolides from two marine Streptomycetes[J]. Journal of Natural Products, 2000,63(11): 1570-1572.

[7] 沈萍, 范秀容, 李廣武. 微生物學實驗[M]. 3版. 北京: 高等教育出版社, 1999: 214-215.

[8] ZHENG Zhonghui, ZENG Wei, HUANG Yaojian, et al. Detection of antitumor and antimicrobial activities in marine organism associated actinomycetes isolated from the Taiwan Strait, China[J]. FEMS Microbiol Lett, 2000, 188(1): 87-91.

[9] 周德慶. 微生物學實驗手冊[M]. 上海: 上?？茖W技術(shù)出版社, 1986.

[10] ROY R N, LASKAR S, SEN S K. Dibutyl phthalate the bioactive compound produced by Streptomyces albidoflavus 321.2[J]. Microbiol Res, 2006, 161(2): 121-126.

[11] EL-NAGGAR M Y M. Dibutyl phthalate and the antitumor agent F5A1,two metabolites produced by Streptomyces nasri submutant H35[J].Biomed Lett, 1997, 55: 125-131.

[12] LEE D S. Dibutyl phthalate, an α-glucosidase inhibitor from Streptomyces melanosporofaciens[J]. J Biosci Bioeng, 2000, 89(3): 271-273.

[13] FOSTER P M D, CATTLEY R C, MYLCHREEST E. Effects of di-nbutyl phthalate (DBP) on male reproductive development in rat: implications for human risk assessment[J]. Food Chem Toxicol, 2000, 38(Suppl 1): 97-99.

[14] MYLCHREEST E, SAR M, CATTLEY R C, et al. Disruption of androgen-regulated male reproductive development by di(n-butyl) phthalate during late gestation in rats is different from flutamide[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 1999, 156(2): 81-95.

[15] WATANUKI H, GUSHIKEN Y, SAKAI M. In vitro modulation of common carp (Cyprinus carpio L.) phagocytic cells by di-n-butyl phthalate and di-2-ethylhexyl phthalate[J]. Aquat Toxical, 2003, 63(2): 119-126.

Isolation, Purification and Solubility of Antibacterial Substances from Fermentation Supernatant of Marine Streptomyces parvus DY2741

LIU Wei1,2，XU Tao2，CAI Jing-min1,2,*，PAN Ren-rui2，WU Ying3
(1. School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；2. Department of Biological and Environmental Engineering, Hefei University, Hefei 230022, China；3. Department of Chemical and Materials Engineering, Hefei University, Hefei 230022, China)

R282.77

A

1002-6630(2010)15-0177-04

2010-04-07

安徽省優(yōu)秀青年科技基金項目(04043051)；國家自然科學基金項目(30270321)；

合肥學院(引進)人才科研啟動基金計劃項目(08RC12)；安徽省教育廳自然科學研究項目(KJ2008B229)

劉偉(1982—)，男，碩士研究生，主要從事海洋微生物天然產(chǎn)物研究。E-mail：bbliuwei@foxmail.com

*通信作者：蔡敬民(1963—)，男，教授，博士，主要從事微生物酶學和海洋微生物活性產(chǎn)物研究。E-mail：caijingmin@hfuu.edu.cn