王 賀，楊瑞金，華 霄，錢婷婷，張文斌，蔣孝燕

(1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

密蘇里游動(dòng)放線菌葡萄糖異構(gòu)酶基因xylA的克隆及其表達(dá)條件的優(yōu)化

王 賀1,2，楊瑞金2,*，華 霄2，錢婷婷1，張文斌2，蔣孝燕2

(1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

為克隆、表達(dá)密蘇里游動(dòng)放線菌葡萄糖異構(gòu)酶(GI)基因xylA，并對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行初步優(yōu)化。采用Slowdown PCR方法克隆得到密蘇里游動(dòng)放線菌(Actinoplanes missouriensis)CICIM B0118(A)的葡萄糖異構(gòu)酶基因xylA，構(gòu)建pET-28a(+)-xylA表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化至E. coli BL21 (DE3)，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果表明，融合蛋白分子質(zhì)量約為45kD。在誘導(dǎo)時(shí)間9h、0.6mmol/L IPTG、30℃和OD600nm值為0.8的最適培養(yǎng)條件下，酶比活力最高達(dá)到62.42U/mL。

密蘇里游動(dòng)放線菌；葡萄糖異構(gòu)酶；表達(dá)；Slowdown PCR

Abstract：The xylA gene encoded glucose isomerase (GI) was amplified from genomic DNA of A. missouriensis CICIM B0118(A) by Slowdown PCR and subcloned into the expression vector pET-28a(+) to obtain an N-terminus His-tagged fusion expression plasmid pET-28a(+)-xylA. pET-28a(+)-xylA was then transformed into E. coli BL21 (DE3). The recombinant protein was actively expressed in E. coli BL21 (DE3) in the presence of isopropy-β-D-thiogalactoside (IPTG). SDS-PAGE analysis showed that the partially purified recombinant protein exhibited a major band with an apparent molecular weight of 45 kD in, which was consistent with the molecular weight calculated from the amino acid sequence. When the induction conditions were time 9h,IPTG 0.6mmol/L, temperature 30℃ and OD600nm 0.8, the enzyme activity of recombinant GI were 62.42 U/mL. These results can offer an experimental basis for the further investigation of directed evolution of GI into an artificial enzyme with the ability to isomerize lactose into lactulose.

Key words：Actinoplanes missouriensis；glucose isomerase；expression；slowdown PCR

葡萄糖異構(gòu)酶(glucose isomerase，GI)又稱木糖異構(gòu)酶，可異構(gòu)化D-葡萄糖、D-木糖等醛糖為相應(yīng)的D-果糖、D-木酮糖等酮糖，是目前工業(yè)上生產(chǎn)果葡糖漿(HFCS)和發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵酶[1]。產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的工業(yè)菌株主要有玫瑰暗黃鏈霉菌(Streptomyces roseofulvus)、密蘇里游動(dòng)放線菌(Actinoplanes missouriensis)[2]和鏈霉菌M1033(Streptomyces diastaticus M1033)[3]等。

密蘇里游動(dòng)放線菌(A. missouriensis)是一種中溫菌，所產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu)酶位于細(xì)胞質(zhì)中，屬于木糖異構(gòu)酶家族Ⅰ。近20年來(lái)，已有不同學(xué)者先后開展對(duì)其作用機(jī)理的研究[4-6]，截至目前關(guān)于該葡萄糖異構(gòu)酶的催化部位、金屬離子結(jié)合位點(diǎn)及其底物結(jié)合位點(diǎn)都已闡述清楚。

本研究組試圖通過定向進(jìn)化改造葡萄糖異構(gòu)酶，以期直接將異構(gòu)乳糖中的葡萄糖單元轉(zhuǎn)化為果糖，從而一步制得乳果糖。乳果糖(β-D-Gal-(1→4)-β-D-Fru)具有調(diào)節(jié)腸道菌群、提高免疫力、改善新陳代謝等獨(dú)特生理功能，是一種藥食兩用的功能性低聚糖。由于現(xiàn)有乳果糖規(guī)?；a(chǎn)所采用的化學(xué)異構(gòu)法[7]給乳果糖產(chǎn)品帶來(lái)了安全性風(fēng)險(xiǎn)，因此生物酶法已成為生產(chǎn)乳果糖的發(fā)展方向。目前該領(lǐng)域研究正處于起步階段，韓國(guó)Deok-Kun Oh研究組報(bào)道了一系列利用β-半乳糖甘酶合成乳果糖的工作[8]，實(shí)驗(yàn)室中得到乳果糖產(chǎn)量約為50g/L。

本實(shí)驗(yàn)以A. missouriensis CICIM B0118(A)為出發(fā)菌株克隆xylA基因，目前尚未見該基因片段在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中成功表達(dá)的先例，Amore等[9]曾嘗試把源于A. missouriensis的xylA克隆至S. cerevisiae中進(jìn)行表達(dá)，盡管能夠檢測(cè)到編碼葡萄糖異構(gòu)酶的mRNA，但卻測(cè)不到葡萄糖異構(gòu)酶的活力。而且國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道該酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)。鑒于此，本研究選取pET-28a作為表達(dá)載體，進(jìn)行對(duì)A. missouriensis CICIM B0118(A)葡萄糖異構(gòu)酶基因xylA在E. coli BL21(DE3)中的表達(dá)，并對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行研究，旨在為下一步利用和改造該酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和HindⅢ、T4 DNA連接酶、DNA Ladder Marker、LA-Taq聚合酶、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal) 大連寶生物公司；酵母提取物、胰蛋白胨、質(zhì)粒抽提試劑盒和低熔點(diǎn)瓊脂糖 上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；膠回收試劑盒 北京索來(lái)寶科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司；核酸染料(Gelgreen) 上海開放科技發(fā)展有限公司；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 上海晶天生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 菌株和質(zhì)粒

A. missouriensis CICIM B0118(A)由中國(guó)高校工業(yè)微生物資源數(shù)據(jù)平臺(tái)提供；E. coli DH5α、E. coli BL21(DE3)和表達(dá)載體pET-28a(+)均由江南大學(xué)食品生物技術(shù)研究中心保藏；克隆載體pMD18-T購(gòu)自大連寶生物公司。

1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基配方見文獻(xiàn)[10]，大腸桿菌重組子在含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.4 方法

1.4.1 基因組DNA的提取

采用天根細(xì)菌基因組提取試劑盒提取A. missouriensis CICIM B0118(A)基因組的DNA。

1.4.2 引物設(shè)計(jì)

按照已公布的A. missouriensis葡萄糖異構(gòu)酶基因序列[11]設(shè)計(jì)引物，委托上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。考慮到大腸桿菌對(duì)密碼子的偏好，在設(shè)計(jì)引物時(shí)將原起始密碼子GTG改為ATG。

上游引物：AATTCCATATG TCTGTCCAG GCCACACGCGAAGACAAG，下劃線部分為NdeⅠ酶切位點(diǎn)；

下游引物：CCCAAGCTT CAGCGGGCTCCGAG CAGGTGCTC，下劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)。

1.4.3 葡萄糖異構(gòu)酶基因的克隆

以抽提的A. missouriensis CICIM B0118(A)基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板，加入合成引物擴(kuò)增目的基因xylA。采用Slowdown PCR[12]，用適合擴(kuò)增高堿基對(duì)GC含量模板的LA-Taq聚合酶對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20μL)：2×GC bufferⅠ10μL，模板DNA 2μL，濃度為20μmol/L的上游引物和下游引物各0.4μL，2.5mmol/L dNTP Mixtures 3.2μL，LA-Taq聚合酶0.2μL，超純水補(bǔ)至總體積為20μL，混勻。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性1min；72～62℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，每3個(gè)循環(huán)退火溫度降低1℃，共循環(huán)30次；95℃變性1min，62℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，循環(huán)15次；最后72℃再循環(huán)10min。

1.4.4 克隆載體的構(gòu)建、鑒定及序列分析

采用膠回收試劑盒對(duì)Slowdown PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到A. missouriensis CICIM B0118(A)葡萄糖異構(gòu)酶基因xylA。將回收的目的片段用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切并純化，然后以適當(dāng)比例與用同樣限制性內(nèi)切酶酶切并純化的pMD18-T載體混合(具體方法按pMD18-T載體試劑盒說明書進(jìn)行)構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-xylA。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，篩選陽(yáng)性克隆子，進(jìn)行序列測(cè)定。

1.4.5 重組大腸桿菌pET-28a(+)-xylA表達(dá)載體的構(gòu)建

將測(cè)序正確的xylA片段和pET-28a(+)質(zhì)粒分別用NdeⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收，16℃過夜，連接目的片段和質(zhì)粒片段，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到重組E. coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-xylA。

1.4.6 誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE檢測(cè)

將經(jīng)鑒定后的陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E. coli BL21(DE3)菌株，同時(shí)以空白質(zhì)粒pET-28a(+)轉(zhuǎn)入相同宿主作為對(duì)照，挑取單菌落到含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，在37℃搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，以體積分?jǐn)?shù)1%接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的50mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于30℃搖床，200r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600nm約為0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.6mmol/L，6～8h后停止培養(yǎng)。取一定體積菌液，4℃、10000r/min離心10min，沉淀用去離子水洗滌兩次，然后重懸于磷酸鹽緩沖液后，冰浴中超聲破壁。4℃、10000r/min離心10min，棄沉淀，上清液繼續(xù)在70℃水浴下熱處理20min以除去其他大部分雜蛋白，之后4℃、10000r/min離心10min，所得上清即為粗酶液。取上述誘導(dǎo)表達(dá)的粗酶液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳[13]，分析重組蛋白的表達(dá)情況。

1.4.7 葡萄糖異構(gòu)酶活力的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)酶反應(yīng)體系組成為：2.5mL 3.0mol/L葡萄糖溶液、0.5mL 0.03mol/L硫酸鎂、0.5mL 0.003mol/L硫酸鈷、1.5mL粗酶液(0.3mol/L pH7.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉)，70℃反應(yīng)1h，取反應(yīng)液按一定倍數(shù)稀釋。果糖含量的測(cè)定參照半胱氨酸-鹽酸鹽-咔唑法[14]。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物中，酶活力單位(U)定義為1h內(nèi)催化產(chǎn)生1mg果糖所需的酶量。蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定：以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)，采用Bradford法測(cè)定[15]。

1.4.8 重組葡萄糖異構(gòu)酶E. coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-xylA表達(dá)條件的優(yōu)化

1.4.8.1 誘導(dǎo)劑IPTG濃度

將重組轉(zhuǎn)化子接種于10mL含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜，然后按體積分?jǐn)?shù)1%接種量轉(zhuǎn)接于6個(gè)含50mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm約為0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)12h，每個(gè)重復(fù)3次。取樣測(cè)酶比活力。

1.4.8.2 誘導(dǎo)菌體起始濃度(OD600nm)

將重組轉(zhuǎn)化子接種于10mL含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜，然后按體積分?jǐn)?shù)1%接種量轉(zhuǎn)接于6個(gè)含50mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.6mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)12h，每個(gè)重復(fù)3次。取樣測(cè)酶比活力。

1.4.8.3 誘導(dǎo)溫度

將重組轉(zhuǎn)化子接種于10mL含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜，然后按體積分?jǐn)?shù)1%接種量轉(zhuǎn)接于4個(gè)含50mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，分別在25、30、34、37℃條件下200r/min繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm約為0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.6mmol/L，共培養(yǎng)20h，每個(gè)重復(fù)3次。取樣測(cè)酶比活力。

1.4.8.4 誘導(dǎo)時(shí)間

將重組轉(zhuǎn)化子接種于10mL含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜，然后按體積分?jǐn)?shù)1%接種量轉(zhuǎn)接于5個(gè)含50mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃、200r/min繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm約為0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.6mmol/L，分別誘導(dǎo)3、6、9、12、16h。取樣測(cè)酶比活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖異構(gòu)酶基因xylA擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用Slowdown PCR方法克隆了編碼葡萄糖異構(gòu)酶基因xylA，所用的聚合酶為L(zhǎng)A-Taq酶，此酶專用于擴(kuò)增高GC含量的模板，它附帶的兩種GC Buffer有利于模板解鏈和引物的結(jié)合，電泳結(jié)果顯示，在1000～1500bp之間出現(xiàn)一條亮帶(條帶2和3)，與目標(biāo)條帶大小吻合，見圖1。相比之下，其他普通DNA聚合酶則很難擴(kuò)增得到目的片段。Slowdown PCR的優(yōu)點(diǎn)在于：降低PCR循環(huán)過程中的升溫和降溫速率，尤其是降溫速率低至1.5℃/s，目的是讓引物和模板充分退火結(jié)合，這一點(diǎn)是常規(guī)PCR、Touchdown PCR和梯度PCR所沒有的。

圖1 Slowdown PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the slowdown PCR product of the xylA gene from A. missouriensis CICIM B0118

2.2 目的片段xylA的克隆與測(cè)序

將膠回收的目的片段與pMD18-T載體連接，構(gòu)建克隆載體pMD18-T-xylA，并轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α受體菌，涂布于含Amp、IPTG、X-gal的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜后，隨機(jī)挑取白色菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序(結(jié)果未列出)。將該序列提交ExPASy網(wǎng)站服務(wù)器(www.expasy.ch)，應(yīng)用Protparam軟件對(duì)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的一些理化性質(zhì)進(jìn)行了分析。該基因長(zhǎng)度為1185bp，GC含量為67.9%，密碼子第三位上的堿基約94%都是G和C，編碼394個(gè)氨基酸，理論相對(duì)分子質(zhì)量為43498.8，理論等電點(diǎn)為5.12。該基因序列已被Genebank收錄，登錄號(hào)為FJ858194。與GeneBank中已公布的兩個(gè)(登錄號(hào)分別為X16042和A10241)源于A. missouriensis編碼的葡萄糖異構(gòu)酶基因具有較高的同源性，分別達(dá)到99.92%和99.75%，同X16042僅在834位的堿基發(fā)生改變，由C突變?yōu)門，但氨基酸仍未改變，屬于同義突變。FJ858194比A10241序列多一個(gè)終止密碼子TGA，其余序列則完全相同。

2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建

將2.2節(jié)中擴(kuò)增的xylA基因片段及載體pET-28a(+)分別用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接，構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a(+)-xylA，結(jié)構(gòu)示意圖見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-xylA構(gòu)建示意圖Fig.2 Construction map of recombinant plasmid pET-28a(+)-xylA

將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E. coli BL21(DE3)受體菌，37℃培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取6個(gè)轉(zhuǎn)化子接種到含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，提取重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，pET-28a(+)-xylA能被NdeⅠ和HindⅢ雙酶切獲得一條長(zhǎng)約1200bp的片段，見圖3。初步證明目的基因xylA已成功同載體pET-28a(+)連接并轉(zhuǎn)入到表達(dá)宿主菌E. coli BL21(DE3)中。

圖3 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-xylA限制性酶切分析Fig.3 Double restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pET-28a(+)-xylA

2.4 SDS-PAGE檢測(cè)

取誘導(dǎo)培養(yǎng)9h后的菌液離心，收集菌體，加上樣緩沖液煮沸10min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。與未插入目的基因的空載體pET-28a(+)相比，含有重組質(zhì)粒pET-28a(+)-xylA的E. coli BL21(DE3)在43kD左右處有明顯的蛋白表達(dá)條帶，見圖4。

圖4 重組蛋白SDS-PAGE電泳分析Fig.4 SDS-PAGE analysis for the expression of pET-28a(+)-xylA in E. coli BL21(DE3)

2.5 E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-xylA表達(dá)條件的優(yōu)化

2.5.1 誘導(dǎo)劑IPTG最適濃度的確定

工程菌體在誘導(dǎo)過程中，物質(zhì)能量代謝及生理生化狀態(tài)都發(fā)生了很大的變化，xylA在大桿菌中的表達(dá)需要誘導(dǎo)劑IPTG，但其濃度過高反而會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)不利[16]，因此獲取合適的誘導(dǎo)劑量對(duì)xylA的表達(dá)很重要。為了研究最適的誘導(dǎo)濃度，選取了0.2～1.2mmol/L之間的IPTG，然后分別測(cè)葡萄糖異構(gòu)酶比活力，結(jié)果見圖5。

圖5 IPTG濃度對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶比活力的影響Fig.5 Effect of IPTG concentration on GI activity

由圖5可知，未加IPTG時(shí)，基本上測(cè)不到葡萄糖異構(gòu)酶比活力，表明pET-28a(+)的T7lac表達(dá)系統(tǒng)十分嚴(yán)謹(jǐn)。當(dāng)IPTG終濃度為0.6mmol/L時(shí)，葡萄糖異構(gòu)酶比活力達(dá)到最高值，表明表達(dá)量最高。但隨著IPTG濃度進(jìn)一步增高時(shí)，酶比活力有所下降。

2.5.2 菌體外源基因誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的確定

外源蛋白的表達(dá)將與宿主本身代謝所需要的前體和能量進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，若誘導(dǎo)過早或過晚，由于菌體早期活力不足或晚期有害代謝產(chǎn)物的累積都會(huì)使外源蛋白的表達(dá)水平下降，因此，考察最佳的起始誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)目的蛋白的表達(dá)非常關(guān)鍵。葡萄糖異構(gòu)酶比活力與菌體濃度OD600nm之間的關(guān)系見圖6。

圖6 工程菌菌體濃度(OD600nm)對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶比活力的影響Fig.6 Effect of engineered strain density (OD600nm) on GI activity

由圖6可知，隨著菌體濃度的增加，酶比活力逐漸升高，當(dāng)重組菌OD600nm約為0.8時(shí)，酶比活力達(dá)到最大值，這與Joo等[17]報(bào)道相一致。OD600nm再進(jìn)一步增加時(shí)，酶比活力反而降低。

2.5.3 誘導(dǎo)溫度對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶表達(dá)的影響

由于T7屬于強(qiáng)啟動(dòng)子，往往會(huì)使外源蛋白過量表達(dá)，但易生成無(wú)活性的包涵體。將重組菌分別在25、30、34、37℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，20h取樣測(cè)酶比活力，所得工程菌產(chǎn)酶比活力與溫度的關(guān)系見圖7。Knappik等[18]曾報(bào)道低溫誘導(dǎo)條件下，蛋白質(zhì)合成速率雖下降，但形成正確折疊構(gòu)象的活性蛋白含量卻在增加；而且Kosinski等[19]也指出低溫誘導(dǎo)，由ATP介導(dǎo)的和非ATP-介導(dǎo)的蛋白酶解水平都會(huì)降低，這些原因促使低溫誘導(dǎo)條件下外源蛋白產(chǎn)量增加。所以，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)溫度太高對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶的活性表達(dá)很不利，而在30℃條件下酶比活力卻很高。

圖7 誘導(dǎo)溫度對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶比活力的影響Fig.7 Effect of induction temperature on GI activity

2.5.4 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶表達(dá)的影響

圖8 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶比活力的影響Fig.8 Effect of length of induction time on GI activity

重組菌產(chǎn)生葡萄糖異構(gòu)酶的量會(huì)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而相應(yīng)增加，當(dāng)加入0.6mmol/L IPTG，誘導(dǎo)9h，酶比活力達(dá)到最高，為62.42U/mL，結(jié)果見圖8。

由圖8可知，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，酶比活力反而有所下降，這與培養(yǎng)后期發(fā)酵液pH值偏堿性有關(guān)。

3 討 論

葡萄糖異構(gòu)酶一直是研究的熱點(diǎn)，曾有許多學(xué)者先后對(duì)來(lái)自大腸桿菌(E. coli)、高溫產(chǎn)硫化氫梭狀芽孢桿菌(Clostridium thermohydrosulfuricum)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、紫紅鏈霉菌(Streptomyces violaceoruber)、淀粉酶鏈霉菌(Streptomyces diastaticus)、赤色鏈霉菌(Streptomyces rubiginosus)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)等菌的葡萄糖異構(gòu)酶進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中成功表達(dá)的例子很多，而在酵母中成功表達(dá)的相對(duì)很少，國(guó)內(nèi)鮑曉明等[20]曾將高溫產(chǎn)硫化氫梭狀芽孢桿菌(Clostridium thermohydrosulfuricum)和嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)的木糖異構(gòu)酶導(dǎo)入釀酒酵母中并得到活性表達(dá)。目前，國(guó)內(nèi)外已開始由對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶的催化機(jī)理研究轉(zhuǎn)移到對(duì)提高酶的耐熱性、拓寬底物特異性、降低果葡糖漿反應(yīng)pH值及發(fā)酵木糖生成乙醇上來(lái)。

產(chǎn)自A. missouriensis的葡萄糖異構(gòu)酶具有活力比較高、最適pH值為7.0和pH值穩(wěn)定范圍為6～9等特點(diǎn)，這些都有利于生產(chǎn)果葡糖漿。更為重要的是現(xiàn)有的研究結(jié)果已清楚地表明該酶的活性部位、底物結(jié)合位點(diǎn)等關(guān)鍵信息，并有學(xué)者通過對(duì)底物結(jié)合位點(diǎn)附近的氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，提高了突變體酶對(duì)L-核糖的反應(yīng)速率。這些相關(guān)信息促使本課題組選擇了A. missouriensis作為改造葡萄糖異構(gòu)酶的出發(fā)菌株。

鑒于Amore等[9]、鮑曉明等[20]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選取大腸桿菌作為表達(dá)宿主菌。來(lái)源于A. missouriensis CICIM B0118(A)的葡萄糖異構(gòu)酶基因xylA，其片段中GC含量達(dá)70%，擴(kuò)增如此高GC含量的目的片段一直是PCR擴(kuò)增中的一個(gè)難題，解決此問題的常用辦法是加入增強(qiáng)劑如DMSO、甲酰胺、甘油、甜菜堿等，但本研究發(fā)現(xiàn)效果并不理想。采用Slowdown PCR方法并使用合適的LA-Taq酶(含兩種GC buffer)，成功克隆得到了A. missouriensis CICIM B0118(A)葡萄糖異構(gòu)酶基因xylA，并實(shí)現(xiàn)了其在E. coli BL21(DE3)中的高效表達(dá)。

外源蛋白在大腸桿菌中的成功表達(dá)不僅需要加入誘導(dǎo)劑IPTG，而且優(yōu)化產(chǎn)酶條件也很重要。通過對(duì)工程菌誘導(dǎo)表達(dá)的主要產(chǎn)酶影響因素：IPTG濃度、誘導(dǎo)起始菌體濃度(OD600nm)、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間等優(yōu)化研究，得到最適培養(yǎng)條件為：0.6mmol/L IPTG、OD600nm值為0.8、30℃和誘導(dǎo)時(shí)間9h。其中誘導(dǎo)溫度對(duì)酶比活力影響很大，結(jié)果表明，30℃是非常適宜的誘導(dǎo)溫度。在上述最適條件下，發(fā)酵液酶比活力達(dá)到62.42U/mL，較野生型提高了12倍。

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Cloning of Glucose Isomerase Gene from Actinoplanes missouriensis and Its Expression in Escherichia coli

WANG He1,2，YANG Rui-jin2,*，HUA Xiao2，QIAN Ting-ting1，ZHANG Wen-bin2，JIANG Xiao-yan2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Q786

A

1002-6630(2010)15-0171-06

2009-12-28

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z336)；江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向資助項(xiàng)目(SKLF-MB-200804)；以乳糖異構(gòu)化為目標(biāo)的葡萄糖異構(gòu)酶定向改造研究(SKLF-TS-200903)；江南大學(xué)博士研究生科學(xué)研究基金項(xiàng)目

王賀(1983—)，男，博士研究生，研究方向?yàn)槭称访傅纳锔男?。E-mail：wanghe.0918@163.com

*通信作者：楊瑞金(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：yrj@jiangnan.edu.cn