曹 磊，張世平，胡億文

（廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院耳鼻喉科，廣東廣州 510220）

噪聲、炎癥及缺氧是導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞損傷的重要原因，而缺氧在其他損傷因素的作用過程中常起著協(xié)同損傷的作用[1]。另外，在分娩過程中引起的新生兒窒息也是導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞損傷的重要原因之一。深入研究缺氧性毛細(xì)胞損傷的分子機(jī)制可為耳蝸相關(guān)性疾病的防治提供理論依據(jù)。熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一類廣泛存在于原核、真核細(xì)胞中，進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞保護(hù)蛋白。它們可在細(xì)胞遭受應(yīng)激損傷（如高溫、缺血、缺氧及炎癥等）時(shí)反應(yīng)性上調(diào)，以保護(hù)細(xì)胞對抗不利環(huán)境引起的損傷。熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）是細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的熱休克蛋白之一，其在螺旋緣、血管紋及毛細(xì)胞均有表達(dá)[2]，而HSP70在缺氧性毛細(xì)胞損傷時(shí)的表達(dá)情況，及其在缺氧性毛細(xì)胞損傷中的作用仍鮮有報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)擬觀察在化學(xué)性缺氧模擬劑氯化鈷（cobaltchloride，CoCl2）損傷毛細(xì)胞時(shí)HSP70的表達(dá)及HSP70在此損傷過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

CoCl2和槲皮素（quercetin，Quer）購自美國 Sigma-Aldrich公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell count kit 8，CCK-8）購自碧云天生物技術(shù)研究所，HSP70抗體由Santa Cruz生物技術(shù)公司提供，DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibico公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

永生化的HEI-OC1聽細(xì)胞株由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。HEI-OC1聽細(xì)胞株具有外耳毛細(xì)胞的特性，能特異性地表達(dá)math1和myosin7a蛋白，在耳毒性的科學(xué)研究中已被廣泛應(yīng)用[3]。HEI-OC1聽細(xì)胞株在33℃、7%CO2條件下，培養(yǎng)于含有15%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中。

1.3 CCK-8比色法檢測細(xì)胞存活率

HEI-OC1聽細(xì)胞株生長至70%融合時(shí)，接種于96孔培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)，經(jīng)不同濃度的CoCl2處理24 h，或用Quer預(yù)處理2 h后再與CoCl2共同處理24 h。處理完成后，每孔加10 μl CCK-8，室溫下輕搖 3 h，用酶標(biāo)儀（ELX-800，BIO-TEK，USA）記錄450 nm波長處的吸光度（A）。取4孔A值的平均數(shù)按公式計(jì)算細(xì)胞存活率，即細(xì)胞存活率（%）=（A處理組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%，重復(fù) 3次。

1.4 Western blot法檢測HSP70蛋白的表達(dá)

HEI-OC1聽細(xì)胞株被接種于35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，經(jīng)CoCl2處理和（或）Quer預(yù)處理后再與CoCl2共同處理。處理完成后，用預(yù)冷的PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液，4℃靜置30 min。12 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉（TBS-T緩沖液）封閉1.5 h，隨后加入HSP70抗體（1∶600）或 β-actin 抗體（1∶10 000），4℃輕搖過夜，TBS-T 緩沖液洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，孵育1.5 h，TBS-T緩沖液洗3次。ECL顯色后，用ImageJ 1.41o進(jìn)行灰度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異采用 One-way ANOVA 及LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氯化鈷誘導(dǎo)HEI-OC1 聽細(xì)胞的缺氧性損傷

見圖1。圖1顯示，150～750 μmol/L濃度的CoCl2作用聽細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率顯著降低，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.01），經(jīng)相關(guān)性分析顯示，具有劑量依賴關(guān)系（r=-0.99）。此結(jié)果表明，化學(xué)性缺氧模擬試劑CoCl2能夠在聽細(xì)胞誘導(dǎo)缺氧性損傷作用。

2.2 氯化鈷上調(diào)HEI-OC1 聽細(xì)胞內(nèi)HSP70 的表達(dá)

聽細(xì)胞經(jīng)300 μmol/L的CoCl2處理不同時(shí)間后，Western blot檢測顯示，細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)較基礎(chǔ)水平顯著上調(diào)（圖 2），30 min 時(shí)開始升高（P<0.05），240 min 時(shí)達(dá)到高峰（P<0.01）。

2.3 槲皮素加重氯化鈷誘導(dǎo)的HEI-OC1 聽細(xì)胞毒性

為了明確HSP70的表達(dá)上調(diào)在CoCl2誘導(dǎo)聽細(xì)胞損傷中的作用，在 300 μmol/L CoCl2處理 24h 前，分別用 20、40和80 mol/L Quer預(yù)處理2 h再與CoCl2共培養(yǎng)，結(jié)果見圖3，Quer劑量依賴性地加重了CoCl2的聽細(xì)胞損傷作用，而Quer本身對細(xì)胞活力并無明顯影響（P>0.05）。

2.4 槲皮素抑制氯化鈷誘導(dǎo)的HEI-OC1 聽細(xì)胞內(nèi)HSP70 的表達(dá)上調(diào)

聽細(xì)胞在經(jīng)300μmol/L的CoCl2處理120min前，用80mol/L Quer預(yù)處理120 min再與CoCl2共培養(yǎng)，Western blot檢測顯示見圖4，Quer本身不影響HSP70的水平，但可明顯抑制CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)上調(diào)（P<0.01）。此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，適應(yīng)性HSP70表達(dá)上調(diào)對缺氧誘導(dǎo)的聽細(xì)胞損傷具有抑制作用。

3 討論

本研究顯示化學(xué)性缺氧模擬試劑CoCl2能在HEI-OC1聽細(xì)胞中引起缺氧性細(xì)胞損傷作用，并上調(diào)HSP70的蛋白表達(dá)。適應(yīng)性HSP70的表達(dá)增加對CoCl2引起的缺氧性聽細(xì)胞損傷具有明顯的抑制作用。這些數(shù)據(jù)可為以HSP70為靶點(diǎn)的缺氧性耳蝸外毛細(xì)胞損傷的治療提供有益的理論支持。

缺氧性耳蝸外毛細(xì)胞損傷是分娩過程中新生兒窒息最常見的并發(fā)癥之一，如不及時(shí)給予恰當(dāng)?shù)闹委煷胧?，聽覺障礙將會(huì)影響人的一生[4]。因而，通過建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，深入研究缺氧性耳蝸損傷的機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。目前使用的動(dòng)物模型包括讓動(dòng)物呼出的氣體進(jìn)行重復(fù)呼吸、堵塞動(dòng)物的氣管或者結(jié)扎小腦前下動(dòng)脈以阻斷耳蝸的血流，這些方法雖然可以獲得缺氧性聽覺障礙的模型，但由于此時(shí)動(dòng)物并非處于生理狀態(tài)，因而反映的不僅僅是耳蝸缺氧引起的聽覺障礙，也可能與聽性腦干受損有關(guān)[5]。CoCl2是常用的缺氧模擬試劑，其中鈷能與鐵競爭氧，從而達(dá)到常氧、缺氧的目的，已經(jīng)在缺氧性損傷的細(xì)胞模型中被廣泛應(yīng)用[6-7]。本研究采用CoCl2損傷具有耳蝸外毛細(xì)胞特性的HEI-OC1聽細(xì)胞，能夠很好地模擬缺氧性耳蝸損傷，為進(jìn)一步分子機(jī)制的探討提供了簡單易行的手段。

HSP70是一類廣泛存在于體內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)蛋白質(zhì)，在多個(gè)器官，如心、腦、肝、腎等組織中均見表達(dá)，但是對于其在正常及損傷的耳蝸內(nèi)的表達(dá)尚存在不同的觀點(diǎn)[2,8-9]。本文觀察到在未受刺激的HEI-OC1聽細(xì)胞內(nèi)有低水平的HSP70的表達(dá)，但當(dāng)給予缺氧刺激時(shí)，HSP70的表達(dá)呈劑量依賴性地增加。研究顯示，在螺旋緣、血管紋、柱狀細(xì)胞及外毛細(xì)胞中可在轉(zhuǎn)錄水平檢測到HSP70的表達(dá)[2]，這為本文提供了重要的實(shí)驗(yàn)支持。本文推測，HSP70表達(dá)增加可能是細(xì)胞為了對抗外源性的損傷作用而啟動(dòng)了自身的防御機(jī)制。

關(guān)于HSP70在外周聽覺系統(tǒng)中的確切作用目前尚不清楚。有些學(xué)者認(rèn)為，在聽覺系統(tǒng)遭受噪聲、缺血、缺氧等損害時(shí)，HSP70的表達(dá)升高具有細(xì)胞保護(hù)作用，能對抗這些應(yīng)激反應(yīng)，使聽覺細(xì)胞免受進(jìn)一步的損害[10]；但是由于其在對應(yīng)激反應(yīng)敏感的細(xì)胞中HSP70優(yōu)先表達(dá)，故也有研究認(rèn)為含有HSP70免疫活性的細(xì)胞可能暗示是易受損害的部位[11]。槲皮素是HSP70的抑制劑，可在多種組織細(xì)胞抑制HSP70的表達(dá)[12]。為了明確HSP70在CoCl2損傷聽細(xì)胞過程中的作用，本文進(jìn)一步應(yīng)用槲皮素抑制HSP70的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)槲皮素對正常細(xì)胞生長沒有明顯的影響，但是可以加重缺氧對細(xì)胞的損傷作用，從而證實(shí)了適應(yīng)性HSP70表達(dá)增加可保護(hù)聽細(xì)胞對抗缺氧誘導(dǎo)的損傷。

總之，本結(jié)果為缺氧性耳毒性的研究提供了簡單易行的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停匾氖?，為HSP70在缺氧性耳毒性中的病理生理學(xué)意義提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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