袁晉峰,潘寶龍

近年來研究表明,一些神經(jīng)退行性疾病如透析性腦病綜合征、老年性癡呆(AD)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(AIS)等可能與鋁毒性有關(guān)[1]。鋁是一種對人體有害的元素,隨著鋁礦開采、煉鋁工業(yè)發(fā)展、鋁制品的制作加工使用、酸雨頻繁發(fā)生、食品添加劑的廣泛應(yīng)用等,鋁以各種形式通過呼吸道、消化道等多種途徑進(jìn)入人體,鋁作業(yè)工人以及普通人群的機(jī)體內(nèi)鋁負(fù)荷越來越高。研究發(fā)現(xiàn),進(jìn)入機(jī)體的鋁以Al(H2O)3+形式與轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白或枸櫞酸離子相結(jié)合,隨血液分布與腦、肝、腎、骨、肺等組織中,長期接觸鋁,可在腦組織中蓄積,干擾腦細(xì)胞活動(dòng),破壞神經(jīng)元結(jié)構(gòu),導(dǎo)致中樞神經(jīng)功能障礙[2,3]。因此,研究三氯化鋁(AlCl3)對認(rèn)知功能的影響有理論和現(xiàn)實(shí)意義。

跳臺試驗(yàn)、避暗試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)是最常用的評價(jià)藥物對學(xué)習(xí)記憶的幾種動(dòng)物模型[4]。記憶過程分為記憶獲得(acquisition)、鞏固(consolidation)和再現(xiàn)(retrieval),并且此 3個(gè)過程有先后次序,即首先是記憶獲得,然后鞏固,最后是再現(xiàn)[5]。根據(jù)記憶形成的特點(diǎn),如果多次反復(fù)予以刺激往往會(huì)加強(qiáng)記憶[6,7]。在評價(jià)藥物對記憶鞏固影響的跳臺試驗(yàn)、避暗試驗(yàn)的模型中,根據(jù)記憶形成的特點(diǎn),當(dāng)小鼠被反復(fù)置于相同環(huán)境和接受多次電刺激時(shí),無疑會(huì)加強(qiáng)記憶的鞏固。但如果小鼠出現(xiàn)相對于陰性對照組潛伏期縮短和錯(cuò)誤次數(shù)增加,可以認(rèn)為該藥物對小鼠記憶的鞏固有影響。同理,在水迷宮試驗(yàn)中則表現(xiàn)為潛伏期的延長和穿越平臺次數(shù)減少。

本實(shí)驗(yàn)通過跳臺試驗(yàn)、避暗試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)檢測小鼠的認(rèn)知功能,探討三氯化鋁對小鼠認(rèn)知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 斷乳昆明種小白鼠(由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供),雌雄各半。隨機(jī)分為對照組與低、中、高劑量組,每組8只。小鼠跳臺反射箱,小鼠避暗反射箱,Morris水迷宮(中國科學(xué)院藥物研究所研制)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 染毒方法 動(dòng)物模型低劑量組、中劑量組、高劑量組分別飼喂含AlCl3飼料1.2mg/(kg?d)、12mg/(kg? d)、120 mg/(kg?d),對照組正常飼養(yǎng)。染毒9個(gè)月后,進(jìn)行小鼠認(rèn)知功能檢測。

1.2.2 認(rèn)知功能檢測

1.2.2.1 小鼠跳臺試驗(yàn) 將小鼠置于反射箱中適應(yīng)2 min,在底部銅柵通電的情況下,直接將動(dòng)物置于平臺上,記錄小鼠被放上平臺到第一次跳下的時(shí)間,稱為LT,小鼠受電擊會(huì)逃避性跳上平臺,然后記錄 5 min內(nèi)小鼠跳下平臺次數(shù),即錯(cuò)誤次數(shù)(EN),LT和EN共同作為記憶成績。

1.2.2.2 小鼠避暗試驗(yàn) 反射箱分單獨(dú)5個(gè)箱,每個(gè)箱大小為36 cm×12 cm×12 cm。將小鼠放入反射箱中適應(yīng)2 min,24 h后在暗室銅柵通電的情況下,將小鼠置于明室,記錄小鼠從明室第一次進(jìn)入暗室的時(shí)間,稱為潛伏期(LT),小鼠受電擊后會(huì)逃避性跑出暗室,然后記錄5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)(EN),LT和EN共同作為記憶成績。

2.2.3 Morris水迷宮試驗(yàn) 迷宮上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī),計(jì)算機(jī)自動(dòng)跟蹤計(jì)時(shí)并記錄游泳軌跡。定位航行試驗(yàn),試驗(yàn)歷時(shí)5 d,每天訓(xùn)練4次。4次潛伏期成績的平均值作為當(dāng)日最終成績進(jìn)入最后統(tǒng)計(jì)?？臻g探索試驗(yàn)(Spatial probe test),第5天下午進(jìn)行空間探索試驗(yàn),撤除平臺,將受試小鼠在西北象限池壁中點(diǎn)面向池壁放入水中,記錄60 s內(nèi)小鼠穿越平臺的次數(shù)作為小鼠的記憶成績。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠跳臺試驗(yàn)檢測結(jié)果 與對照組相比,高、中劑量組小鼠跳臺試驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)增多(P＜0.05),高、中劑量組與對照組相比潛伏期縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各鼠小鼠跳臺試驗(yàn)結(jié)果(±s)

表1 各鼠小鼠跳臺試驗(yàn)結(jié)果(±s)

組別 n 潛伏期(s) 錯(cuò)誤數(shù)(次)對照組 8 141.50±68.67 0.43±0.65低劑量組 8 94.07±47.64 0.71±0.83中劑量組 8 47.31±15.881) 1.56±1.031)高劑量組 8 20.50±11.771) 1.93±1.071)與對照組比較,1)P＜0.05

2.2 小鼠避暗試驗(yàn)檢測結(jié)果 與對照組相比,高、中劑量組小鼠避暗試驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)增多(P＜0.05);高、中劑量組與對照組相比潛伏期縮短(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠避暗試驗(yàn)結(jié)果(±s)

表2 各組小鼠避暗試驗(yàn)結(jié)果(±s)

組別 n 潛伏期(s) 錯(cuò)誤數(shù)(次)對照組 8 227.57±32.46 0.43±0.65低劑量組 8 199.57±39.63 0.57±0.85中劑量組 8 125.56±48.351) 1.31±1.011)高劑量組 8 81.36±37.191) 1.64±1.341)與對照組比較,1)P＜0.05

2.3 Morris水迷宮試驗(yàn) 定位航行實(shí)驗(yàn),經(jīng)多組比較單因素方差分析,各組平均潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),與對照組相比,高劑量組平均潛伏期增加(P＜0.05)。空間搜索實(shí)驗(yàn),經(jīng)多組比較的單因素方差分析,各組穿越平臺的次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),與對照組相比,中劑量組、高劑量組穿越平臺的次數(shù)與對照組相比明顯減少(P＜0.05)。詳見表3。

表3 小鼠Mo rris水迷宮潛伏期試驗(yàn)結(jié)果(±s)

表3 小鼠Mo rris水迷宮潛伏期試驗(yàn)結(jié)果(±s)

組別 n 水迷宮潛伏期(s)第1天 第2天 第3天 第4天 第5天穿越平臺次數(shù)次對照組 8 49.5±6.9 37.4±5.2 28.8±5.0 22.5±6.4 16.8±4.4 6.57±1.21低劑量組 8 52.9±6.5 43.7±5.6 32.5±6.6 25.2±5.9 21.6±5.7 5.00±0.63中劑量組 8 53.3±4.8 45.0±6.3 34.1±5.3 28.1±5.9 22.4±6.41) 3.50±0.541)高劑量組 8 58.0±3.51) 50.4±7.71) 43.0±6.31) 41.7±6.11) 39.8±5.91) 2.18±1.221)與對照組比較,1)P＜0.05

3 討 論

鋁化合物具有神經(jīng)毒性作用,可以誘發(fā)神經(jīng)變性,大量資料表明鋁可通過血腦屏障進(jìn)入腦組織,導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙,并與AD等神經(jīng)退行性疾病有關(guān),鋁可引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡,鋁對學(xué)習(xí)記憶過程的細(xì)胞信使和信使分子有明顯影響,鋁直接損傷記憶的生理基礎(chǔ)——突觸可塑性[8]。鋁對組織器官的損傷作用在臨床上和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都得到了廣泛證實(shí)[9-11]。Rankin等指出攝食過程中進(jìn)行鋁暴露的大鼠其后代有行為上和神經(jīng)生化上的改變。流行病學(xué)研究顯示,環(huán)境鋁水平增高,特別是飲水中鋁濃度升高與認(rèn)知損害和癡呆有一定關(guān)系[12-14]。據(jù)相關(guān)慢性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,腦、脊髓等組織中鋁含量和鋁注射量呈正相關(guān),在腦毛細(xì)血管、內(nèi)皮細(xì)胞和腦組織中都有鋁的存在,以前頂皮質(zhì)、海馬和紋狀體最多。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),長期飲有高濃度的AlCl3溶液可使小鼠腦濕重明顯減輕,研究結(jié)果顯示,慢性鋁中毒使大鼠的空間分辨學(xué)習(xí)記憶能力和運(yùn)動(dòng)能力明顯降低。

鋁對學(xué)習(xí)記憶的抑制作用已在實(shí)驗(yàn)和臨床上得到證實(shí)。但以往對鋁的神經(jīng)毒性研究多采取急性暴露或體外實(shí)驗(yàn)方法,少數(shù)慢性毒性研究則常以腹腔注射或灌胃方式為主,與人體實(shí)際情況下經(jīng)水或食物的慢性攝鋁方式不符。本次研究以飼料中添加AlCl3的方式對斷乳小鼠進(jìn)行染毒9個(gè)月后,對小鼠進(jìn)行認(rèn)知功能檢測。檢測跳臺試驗(yàn)潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)共同作為記憶成績。避暗試驗(yàn),潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)共同作為記憶成績。水迷宮試驗(yàn):①定位航行試驗(yàn)潛伏期;②空間探索試驗(yàn)撤除平臺后,記錄60 s內(nèi)小鼠穿越平臺次數(shù)作為小鼠記憶成績。跳臺試驗(yàn)、避暗試驗(yàn)是根據(jù)記憶形成特點(diǎn),將小鼠反復(fù)置于相同環(huán)境并接受多次電刺激,無疑會(huì)加強(qiáng)記憶的鞏固。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,中劑量組和高劑量組相對于對照組潛伏期縮短且錯(cuò)誤次數(shù)增加,可以認(rèn)為三氯化鋁對小鼠記憶鞏固有影響。在水迷宮試驗(yàn)中則表現(xiàn)為相對于對照組,中、高劑量組潛伏期延長和穿越平臺次數(shù)減少,高劑量組與對照組差異更加明顯。鋁可引起脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)和自由基增多,可直接損傷各種酶類、載體、受體、通道和蛋白質(zhì),進(jìn)而影響長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的形成和維持,影響學(xué)習(xí)記憶。本次研究結(jié)果顯示,慢性鋁中毒使小鼠的空間分辨學(xué)習(xí)記憶能力和運(yùn)動(dòng)能力明顯降低,和以往研究結(jié)果相符。

本次研究表明,三氯化鋁可引起小鼠認(rèn)知功能障礙,攝入三氯化鋁量越大,對小鼠認(rèn)知功能影響越大,可以推測三氯化鋁可以引起小鼠認(rèn)知功能障礙,但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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