張 金,李 陽,魏利華

目前許多研究已證實(shí)了腦缺血后損傷區(qū)有細(xì)胞因子的表達(dá)和炎性細(xì)胞的浸潤,從而通過炎癥反應(yīng)加重組織損傷。大量證據(jù)表明,與再灌注有關(guān)的急性炎癥反應(yīng)促進(jìn)了繼發(fā)性腦損傷的發(fā)展,而缺血再灌注早期產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子構(gòu)成了缺血性損傷向炎癥性損傷轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)。而白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1、腫瘤壞死因子(TNF-α)等是主要的炎癥因子,參與了腦缺血損傷的多個(gè)環(huán)節(jié)。其中IL-6作為一種炎癥反應(yīng)的前細(xì)胞因子在其中起著非常重要的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 健康成年雄性SD大鼠40只,體重為80 g～100 g,由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。先用雙腎雙夾法制成高血壓模型[1],再隨機(jī)將高血壓大鼠分為:假手術(shù)組(n=4);缺血 2 h 組再分為再灌注 3 h、12 h、24 h、3 d組(n=8)。IL-6 ELISA試劑盒購于Bender公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腎性高血壓動(dòng)物模型的復(fù)制 將雄性健康的SD大鼠用雙腎雙夾法制成高血壓模型,以普通飼料、飲水飼養(yǎng),術(shù)前3 d(每日1次)連續(xù)所測血壓的平均值為基礎(chǔ)血壓,術(shù)后每周測血壓1次,直至血壓達(dá)到180 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)以上并維持不變,飼養(yǎng)10周～12周。

1.2.2 局灶性腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型的制備

1.2.2.1 尼龍線栓子的制備 參考Zea Longa方法,將一長40 mm,直徑為0.205 mm的清潔魚線一端前7 mm粘上硅橡膠成直徑約0.30 mm,然后于距線球頭端18.5 mm處標(biāo)記。

1.2.2.2 大鼠腦缺血再灌注模型制備 取大鼠,用10%水合氯醛腹腔麻醉(35 mg/100 g)仰于手術(shù)臺(tái)上,行頸正中約2 mm切口,暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)及枕動(dòng)脈,用電凝器燒斷ECA的分支,結(jié)扎并游離ECA主干一段,在近顱底處分離頸內(nèi)動(dòng)脈顱外段唯一分支-翼腭動(dòng)脈,并將其起始部結(jié)扎。在ECA剪一小口,將所做成線栓子插入ECA及ICA入顱至大腦中動(dòng)脈(MCA)開口處,尼龍線插入深度平均為(18.5±0.5)mm。再灌注時(shí)外拉尼龍線抽出ICA即可恢復(fù)ICA的及MCA的血液供應(yīng)[2]。假手術(shù)組除不插入尼線外其余步驟同上。

1.2.2.3 大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的神經(jīng)功能評(píng)分 參考Zea Longa[3]的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分別于大鼠術(shù)后清醒時(shí)進(jìn)行評(píng)分,分為:0分,無神經(jīng)損傷癥狀;1分,不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢;2分,爬行時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分,行走時(shí)身體向?qū)?cè)傾倒;4分,不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失。評(píng)分為0分和4分者均被剔除。

1.3 標(biāo)本采集與保存 在規(guī)定時(shí)間斷頭取腦,在斷頭取腦前先經(jīng)腹主動(dòng)脈采血,室溫下放置 1 h,2 000 r/min離心 30 min,分離血清于帶蓋聚乙烯塑料管中,放于-80℃冰箱內(nèi)保存待測。腦組織自中線處分為兩半,再以1 mg腦組織250 μ L雙蒸水(其中加入蛋白酶抑制劑)用玻璃勻漿機(jī)制成勻漿,再用2000 r/min離心10 min,去除紅細(xì)胞和碎屑,取上清液保存在-80℃冰箱內(nèi)。

1.4 IL-6 ELISA檢測步驟 嚴(yán)格按照IL-6 ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行操作,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照描繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,再根據(jù)所測得的OD值來計(jì)算出IL-6的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,血壓的統(tǒng)計(jì)用重復(fù)測量方差分析,IL-6的濃度用雙因素方差分析。組間比較進(jìn)行F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 RHR血壓及大鼠腦缺血再灌注模型制備 40只大鼠行腎動(dòng)脈狹窄手術(shù)后1周血壓即開始上升,術(shù)后第7天由平均基礎(chǔ)血壓98.3 mmHg上升到124.6 mmHg,第3周時(shí)血壓達(dá)到149.6 mmHg,在第6周后血壓為 188.3 mmHg,顯著高出術(shù)前血壓(P＜0.01),以后逐漸平穩(wěn),波動(dòng)減小,此時(shí)已形成腎性高血壓,再行腦缺血再灌注M ACO手術(shù),術(shù)后出現(xiàn)腦缺血對(duì)側(cè)神經(jīng)功能缺損癥狀的為模型成功,手術(shù)意外死亡和模型不成功的有4只。

2.2 腦缺血再灌注后不同時(shí)間段IL-6在外周血及腦內(nèi)的表達(dá) 大鼠局灶性腦缺血再灌注后IL-6表達(dá)在血清及腦內(nèi)均有上調(diào),在血清中IL-6的表達(dá)高峰在缺血再灌注12 h,并隨時(shí)間延長其表達(dá)水平逐漸下降,在缺血再灌注24 h后降至正常水平;而在腦脊液中IL-6在缺血側(cè)腦組織的表達(dá)在缺血2 h組再灌注3 h后就有明顯升高,并且在缺血2 h后再灌注24 h后達(dá)到高峰,并且在缺血再灌注3 d后,仍維持在較高水平;在非缺血側(cè)腦組織中IL-6的表達(dá)也明顯高于外周血。詳見表1。

表1 腦缺血再灌注后不同時(shí)間段IL-6在外周血及腦內(nèi)的表達(dá)(±s)

表1 腦缺血再灌注后不同時(shí)間段IL-6在外周血及腦內(nèi)的表達(dá)(±s)

組別 n 缺血側(cè)(μ g/mL) 對(duì)側(cè)腦(μ g/mL) 外周血(μ g/mL)假手術(shù)組 4 1.95±0.39 2.14±0.53 0.84±0.14缺血2 h組再灌注3 h組 8 2.77±0.41 2.24±0.40 0.55±0.37缺血2 h組再灌注12 h組 8 3.65±0.861)3) 3.01±0.801) 1.38±0.221)缺血2 h組再灌注24 h組 8 6.20±1.082)3) 4.71±0.611) 1.01±0.31缺血2 h組再灌注3 d組 8 4.40±0.931) 3.92±0.721) 0.79±0.28與假手術(shù)組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與同組外周血比較,3)P＜0.01

3 討 論

IL-6是一種與炎癥調(diào)節(jié)和免疫反應(yīng)有關(guān)的多功能細(xì)胞因子,在缺血性卒中各種類型的外周血中均有IL-6的表達(dá)[4],但對(duì)于IL-6在缺血性卒中的功能不甚清楚,可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有致炎和抗炎的雙重性。

本研究顯示,大鼠局灶性腦缺血再灌注后IL-6表達(dá)在血清及腦內(nèi)均有上調(diào),尤其在腦內(nèi)上調(diào)更為明顯,表明腦組織中IL-6并非完全來源于外周血,腦組織自身能夠產(chǎn)生大量的IL-6。但對(duì)于腦內(nèi)IL-6的細(xì)胞來源尚不完全清楚,可能來源于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、外周血中的單核細(xì)胞等,缺血后腦組織內(nèi)有神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)IL-6mRNA[5,6]。

血清中IL-6的表達(dá)高峰在缺血再灌注12 h,并隨時(shí)間延長其表達(dá)水平逐漸下降,在缺血再灌注24 h后降至正常水平;而腦內(nèi)缺血側(cè)腦組織中IL-6的水平在缺血2 h組再灌注3 h后就有明顯升高,并且在缺血2 h后再灌注24 h后達(dá)到高峰;在非缺血側(cè)腦組織中也有IL-6的表達(dá)。IL-6在缺血側(cè)高表達(dá)可能與缺血刺激誘導(dǎo)皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元表達(dá)有關(guān),在非缺血側(cè)腦組織表達(dá)可能與一側(cè)大腦動(dòng)脈缺血后引起遠(yuǎn)離缺血區(qū)的腦組織血流改變及腦組織的水腫,激活了對(duì)側(cè)神經(jīng)元所致[6]。

研究發(fā)現(xiàn)缺血側(cè)腦組織中IL-6的水平明顯高于對(duì)側(cè)腦組織及外周血中的水平,并且在缺血再灌注3 d后,仍維持在較高水平,說明IL-6升高有其一定的生物學(xué)作用。許多研究發(fā)現(xiàn)IL-6對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元免受谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡有保護(hù)作用[7];IL-6能抑制缺血后激活膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元等釋放IL-1和TNF-α,并能刺激產(chǎn)生它們各自的循環(huán)拮抗劑,對(duì)抗IL-1和TNF-α所致的炎癥損傷。但I(xiàn)L-6的過度表達(dá)在轉(zhuǎn)基因大鼠或見血屏障的破壞和嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙[8],出現(xiàn)震顫、共濟(jì)失調(diào)和抽搐發(fā)作等?？傊?腦內(nèi)IL-6水平的升高并非完全來源于外周血,腦組織自身也產(chǎn)生IL-6,但其具體在腦內(nèi)的生物學(xué)作用還有待進(jìn)一步探討。

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