顏永進(jìn),張躍明,陸 洋,王世亞

心肌缺血再灌注損傷受到臨床越來越多的重視,缺血再灌注損傷成為阻礙缺血心肌從再灌注治療中獲益的主要難點(diǎn),而抑制心肌細(xì)胞凋亡能有效抑制心肌再灌注損傷。葛根素(Puerarin,Pur)是中藥葛根的有效成分之一,具有擴(kuò)張冠狀動脈、改善缺血區(qū)心肌血供、阻滯β受體、降低心肌耗氧量等多種藥理作用[1,2],已被廣泛用于心血管疾病的治療。研究表明,中藥Pur對再灌注損傷的心肌具有保護(hù)作用,但大多數(shù)研究都是在冠脈缺血前給予Pur預(yù)處理,而有關(guān)Pur后處理對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究較少[3,4]。本研究旨在利用大鼠在體心肌缺血模型,觀察葛根素后處理對缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和設(shè)備 Cardiofax型心電圖機(jī)(日本NIHON KOHDEN公司);小動物呼吸機(jī)(江灣Ⅰ型微型,第二軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器公司);Bcl-2、Bax、Tunel試劑盒購自北京中山生物工程有限公司;日本電子GEOLTEM-100S透射電鏡。葛根素由南京正大天晴公司提供。

1.2 心肌缺血再灌注模型的建立[5]以3%戊巴比妥鈉按50 mg/kg腹腔麻醉,氣管插管,連續(xù)監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電圖。開胸暴露心臟,在冠狀動脈前降支距左心耳下緣2 mm處穿過絲線,夾緊絲線阻斷冠脈血流,放松絲線造成再灌注,以左室前壁發(fā)紺或呈紫色及同步心電圖示ST段抬高、QRS幅度升高為結(jié)扎成功標(biāo)志,復(fù)灌時(shí)左室前壁缺血區(qū)發(fā)紺消失。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 健康雄性SD大鼠24只,體重240 g～350 g(由南通醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供),隨機(jī)分成3組,每組8只。假手術(shù)組(A組):將大鼠行上述處理后,只穿線,不結(jié)扎左冠狀動脈。缺血再灌注組(B組):將大鼠行上述處理后,結(jié)扎左冠狀動脈45 min,爾后再灌注120 min。缺血再灌注+葛根素后處理組(C組):將大鼠行上述處理后,結(jié)扎左冠狀動脈 45 min,爾后再灌注120 min。再灌注前3 min和再灌注后2 min內(nèi)靜脈注入葛根素150 mg/kg。

1.4 心肌組織切片的制作 A組術(shù)后165 min,B組和C組在缺血45 min、再灌注120 min后為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動物,立即摘取心臟,剪去心房、大血管及右室,保留左室及室間隔。用4%多聚甲醛,室溫固定,石蠟包埋,連續(xù)切片,用于HE染色、T UHEL檢測、免疫組化檢測Bcl-2、Bax。

1.5 觀測指標(biāo)

1.5.1 光鏡和電鏡下觀測心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué) 光鏡下觀測各組心肌細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài),電鏡觀測心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.5.2 原位末端標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)檢測心肌細(xì)胞的凋亡 各組實(shí)驗(yàn)完畢后,取心肌常規(guī)脫水固定,石蠟包埋、切片,從各組取8張石蠟切片,每張切片按寶靈曼公司試劑盒(POD)提供的脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)原位檢測凋亡細(xì)胞的DNA碎片。以PBS緩沖液代替管1(TdT),進(jìn)行反應(yīng)作陰性對照。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核為深淺不一的棕黃色或棕褐色,非凋亡細(xì)胞核呈藍(lán)色。凋亡指數(shù)的計(jì)算,以單位面積內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)為凋亡指數(shù)(Apotosis index,AI)。每張切片隨機(jī)10個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中凋亡的陽性數(shù),然后加在一起再除10,即可得到凋亡陽性細(xì)胞的百分率。

1.5.3 免疫組化檢測Bcl-2、Bax蛋白水平 應(yīng)用與 TUNEL法相同的組織石蠟切片行Bax、bcl-2蛋白免疫組織化學(xué)檢測。一抗1:50PBS稀釋的 Bax、bcl-2抗體。具體步驟嚴(yán)格按SP試劑盒說明操作,DAB顯色,中性樹脂封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色,細(xì)胞核呈藍(lán)色為不表達(dá)。每張切片隨機(jī)10個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中Bax、bcl-2蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù),然后加在一起再除10,即可得到蛋白陽性表達(dá)的百分率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用STATA8.0軟件進(jìn)行處理,所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,對均數(shù)進(jìn)行方差分析(F檢驗(yàn)),兩組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 心肌組織形態(tài)學(xué)分析 光鏡下:A組心肌纖維形態(tài)正常,未見明顯的壞死表現(xiàn),細(xì)胞核完整,無炎性細(xì)胞浸潤;B組心肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂,無炎性細(xì)胞浸潤,可見凋亡細(xì)胞,呈細(xì)胞體積縮小,密度增加,但細(xì)胞器保持完整;C組心肌纖維形態(tài)趨于正常,無炎性細(xì)胞浸潤。

電鏡下:A組細(xì)胞形態(tài)正常;B組可見細(xì)胞體積縮小,核濃縮,胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器完整,并形成凋亡小體,無炎性細(xì)胞浸潤等凋亡改變;C組細(xì)胞形態(tài)趨于正常,與B組相比,細(xì)胞損傷有明顯減輕,大部分核染色質(zhì)分布均勻,超微結(jié)構(gòu)趨于與A組細(xì)胞相似。

2.2 心肌細(xì)胞凋亡的檢測 A組偶見凋亡的心肌細(xì)胞,B組凋亡細(xì)胞明顯增加,呈彌漫分布,C組凋亡細(xì)胞較少。B組有較高的心肌細(xì)胞凋亡率,較A組明顯增高(P＜0.05);與B組比較,C組心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低(P＜0.05)。詳見表1。

2.3 Bcl-2及 Bax蛋白表達(dá)水平 Bcl-2及Bax蛋白陽性定位于細(xì)胞質(zhì)中,呈棕黃色。B組Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)率明顯低于A組(P＜0.05),而Bax陽性細(xì)胞表達(dá)率明顯高于 A組(P＜0.05);與B組比較,C組Bax陽性細(xì)胞表達(dá)率明顯下降(P＜0.05),而Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)率明顯上升(P＜0.05)。詳見表 1。

表1 不同處理組凋亡細(xì)胞及Bcl-2、Bax蛋白(±s)

表1 不同處理組凋亡細(xì)胞及Bcl-2、Bax蛋白(±s)

組別 凋亡指數(shù)(%) Bcl-2(%) Bax(%)A 組 0.509±0.126 5.618±0.685 0.651±0.083 B組 3.518±0.8641) 0.592±0.4131) 4.982±0.2361)C組 2.075±0.9832) 3.948±0.4132) 1.985±0.5162)與A組比較,1)P＜0.05;與B組比較,2)P＜0.05

3 討 論

葛根素是從野生葛根中提取得到的類異黃酮類化合物,能改善微循環(huán),擴(kuò)張冠狀動脈,增加腦和冠狀動脈血流量等作用,臨床用于冠心病、高血壓等。目前已知的保護(hù)心臟,減少心肌缺血再灌注損傷最有力的方法是缺血預(yù)適應(yīng)或缺血后適應(yīng)[6,7]。近年來實(shí)驗(yàn)及臨床研究均證實(shí)葛根素預(yù)處理對心肌I/R損傷具有良好的保護(hù)作用[8],但對于葛根素后處理以及它對細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)基因 Bcl-2、Bax作用,對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究較少。

細(xì)胞凋亡是有許多基因參與的細(xì)胞結(jié)束其生命的過程,有著非常復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制,其中Bcl-2基因家族是目前較為公認(rèn)與凋亡密切相關(guān)的基因。Bcl-2家族正是一組通過影響線粒體外膜上通透性轉(zhuǎn)換(permeability transition,PT)通道的穩(wěn)定性來調(diào)控細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)。Bcl家族大致可以分為兩類:Bcl-2,Bcl-xL等可以抑制凋亡;而Bax,Bad等則可以通過增加PT通道的開放來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2抗凋亡的作用可能與抗氧自由基,鈣超載及細(xì)胞內(nèi)蛋白酶變化有關(guān),也可能與Bcl-2能保持線粒體膜的穩(wěn)定性,抑制細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子釋放有關(guān)。Bcl-2家族中Bax功能與Bcl-2相反,具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,Bax通過與線粒體上Bcl-2蛋白形成二聚體發(fā)揮作用,當(dāng)Bax高表達(dá)時(shí),形成同源二聚體Bax/Bax促進(jìn)凋亡,Bcl-2高表達(dá)時(shí),形成異源二聚體Bcl-2/Bax以抑制凋亡的發(fā)生[9-11]。

本研究發(fā)現(xiàn),正常心肌細(xì)胞有一定量的Bcl-2、Bax表達(dá);當(dāng)心肌遭遇缺血再灌注時(shí),Bcl-2的表達(dá)下調(diào),而Bax表達(dá)上調(diào)同時(shí)伴有心肌凋亡細(xì)胞的增多;葛根素后處理可以提高Bcl-2表達(dá),降低Bax表達(dá),而且顯著減少心肌細(xì)胞的凋亡。

本研究觀察葛根素后處理對缺血再灌注心肌的保護(hù)作用,對缺血再灌注心肌組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)進(jìn)行了觀察。葛根素后處理能明顯減少心肌細(xì)胞的凋亡,其機(jī)制可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),下調(diào)Bax蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。葛根素后處理是在心肌缺血發(fā)生之后進(jìn)行的,彌補(bǔ)了葛根素預(yù)處理臨床應(yīng)用的缺陷,因此更具臨床前景。

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