劉明綬,陳發(fā)河，吳光斌

（集美大學生物工程學院，福建廈門361021）

響應面法優(yōu)化菠蘿皮色素提取工藝研究

劉明綬,陳發(fā)河*，吳光斌

（集美大學生物工程學院，福建廈門361021）

研究菠蘿皮色素浸提工藝，旨在促進菠蘿皮的綜合利用。通過單因素和正交試驗確定有機溶劑浸提菠蘿皮干粉和鮮皮2條工藝；通過對比，選擇干粉色素浸提工藝并采用響應面進一步優(yōu)化工藝參數(shù)，確定最終優(yōu)化工藝為浸提溶劑75%乙醇，料液比1∶60(g/mL)，溫度70℃，破碎度過10目，浸提級數(shù)2級，1級2 h，2級0.5 h。采用此工藝得到的菠蘿皮油溶性色素粗品色價E1%1cm415nm=9.031，其總類胡蘿卜素含量為3.149mg/g；水溶性色素粗品色價E1%1cm280nm=7.413，其總黃酮含量為2.451 mg/g；黃酮粗品總黃酮含量為245.966 mg/g。

菠蘿皮；色素；浸提；響應面

Abstract:In order to achieve the comprehensive utilization of pineapple peel,the extraction process of pigment from pineapple peel was studied.By single factor and orthogonal tests,2 organic solvent extraction process route of both fresh and dry pineapple peel were determined.By contrast,the process route of dry pineapple peel was chosen and its process parameters were further optimized using the response surface method,the ultimate optimal process was：75%ethanol as extraction solvent,solid and liquid ratio 1∶60(g/mL),extraction temperature 70 ℃,degrees of fragmentation：through 10 meshes,the number of extraction cycles：2,extraction time of cycle 1 ∶2 h,cycle 2 ∶0.5 h.The products got by applying this process were as follow：oil-soluble pigment from pineapple peel,colour value：E1%1cm415 nm=9.031,its total content of carotenoids：3.149 mg/g;water-soluble pigment from pineapple peel,colour value：E1%1cm280 nm=7.413,its total content of flavonoids 2.451 mg/g;flavone from pineapple peel,its total content of flavonoids：245.966 mg/g.

Key words：pineapple peel；pigment；extraction；response surface methodology(RSM)

菠蘿皮是菠蘿果實加工的副產物，約占全果重量的30%，若不加以處理而棄置，將會對環(huán)境造成污染，同時也是對資源的極大浪費。為了有效的利用這一資源，國內外學者在其綜合利用方面作了大量的研究工作。目前，對菠蘿皮渣的開發(fā)利用研究主要有：果酒、白蘭地、果醋[1]，乳酸、乳酸飲料[2]，果凍、菠蘿皮汁、飼料[3-4]，單細胞蛋白[5]，有機肥料、氫氣、乙醇、沼氣[6]，菠蘿蛋白酶[7]，果膠、色素[8-9]，膳食纖維[10-11]，半纖維素多糖[12]，檸檬酸[13]，酚類物質[14-15]，微生物培養(yǎng)基、碳鋼緩蝕劑、膠乳生物凝固劑[16-18]等。有關菠蘿皮色素提取工藝優(yōu)化方面的報道較少。

天然色素是由動物、植物、微生物及礦物中提取的一類著色劑。常用的天然色素主要是從植物、微生物中提取的色素和少量的動物色素[19]。近年來，由于合成色素的使用對人體健康的潛在危害不斷被揭示，天然色素重新受到了人們的熱切關注。天然色素的提取方法主要有溶劑提取法、超臨界流體萃取法、微波輔助溶劑提取法、超聲波輔助溶劑提取法、酶解輔助溶劑提取法、高壓輔助溶劑提取法等，其中溶劑提取法最為常用。本文以溶劑提取法中最常用的有機溶劑和混和溶劑為重點，對菠蘿皮色素的提取工藝進行了優(yōu)化研究，旨在為菠蘿皮色素的開發(fā)利用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、儀器與設備

菠蘿皮：收集水果店剛削下的新鮮菠蘿皮，經適當處理后作為試驗原料。

無水乙醇（分析純）、石油醚（分析純）、乙酸乙酯（分析純）、硝酸鋁（分析純）等。

UV-2006A型紫外可見分光光度計：尤尼柯上海儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；KDC-1044離心機：科大創(chuàng)新有限公司中佳分公司等。

1.2 方法

1.2.1 溶劑法提取干菠蘿皮色素工藝條件的確定

選用40%、60%、70%、80%、95%乙醇、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、混和溶劑Ⅰ（V石油醚∶V乙酸乙酯=4∶1）和混和溶劑Ⅱ（V石油醚∶V無水乙醇=4∶1）10種溶劑進行浸提試驗。選擇70%乙醇為浸提溶劑，323 nm和421.1 nm為測定吸收波長，通過單因素試驗考察料液比、浸提溫度、浸提時間和破碎度對浸提色素量的影響（浸提色素量為浸提濾液測定波長下吸光度、稀釋倍數(shù)、體積3者的乘積）。再選擇乙醇濃度、料液比、水浴溫度、浸提時間4個因素，進行L9(34)正交優(yōu)化，最后確定提取級數(shù)。

1.2.2 溶劑法提取新鮮菠蘿皮色素工藝條件的確定

取7份經清洗破碎后的新鮮菠蘿皮3 g，分別加入30 mL 40%、60%、70%、80%、90%、95%乙醇和無水乙醇，進行溶劑選擇試驗。選擇90%乙醇為浸提溶劑，421.1 nm為測定吸收波長，考察料液比、浸提溫度和浸提時間對浸提色素量的影響。再選擇乙醇濃度、料液比、水浴溫度、浸提時間4個因素，進行L9(34)正交優(yōu)化，最后確定浸提級數(shù)。

1.2.3 菠蘿皮干粉和鮮皮色素浸提工藝路線的比較

精確稱量過10目的菠蘿皮干粉1.255 g，80%乙醇 63 mL，70℃水浴，一級浸提 80 min，二級浸提40 min，合并濾液，濃縮后用石油醚萃取，合并石油醚層定容到100 mL；水相過濾后定容至100 mL。觀察色澤，掃描油相和稀釋10倍后的水相在200 nm～600 nm的吸收光譜。精確稱量破碎后的新鮮菠蘿皮10.000 g，90%乙醇90 mL，60℃水浴，一級浸提2 h，二級浸提0.5 h，后續(xù)操作同上。

1.2.4 菠蘿皮干粉色素浸提工藝的響應面優(yōu)化

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，選取乙醇濃度、料液比、水浴溫度、浸提時間4個因素，分別以 X1、X2、X3、X4表示，每個自變量的低、中、高水平分別以-1、0、1進行編碼，以浸提色素量作為響應值(Y)，對菠蘿皮粉色素浸提工藝進行響應面優(yōu)化。

1.2.5 菠蘿皮色素粗品色價和主要顯色成分含量的測定

1.2.5.1 菠蘿皮色素粗品的制備

過10目的菠蘿皮粉適量，采用最終優(yōu)化的浸提工藝浸提，濃縮浸提液至約1/10體積，用石油醚分次萃取至石油醚層基本無色，過濾合并石油醚層濃縮干燥得菠蘿皮油溶性色素粗品；合并萃取后的水層濃縮后離心，上清液濃縮干燥得菠蘿皮水溶性色素粗品；沉淀用少量水洗出干燥得菠蘿皮黃酮粗品。

1.2.5.2 菠蘿皮色素粗品色價的測定

精確稱量色素粗品1 g（準確至0.0002 g）溶解定容到100 mL。菠蘿皮水溶性色素粗品以純水為溶劑，油溶性色素粗品以石油醚為溶劑，測定色價[20]。

1.2.5.3 菠蘿皮油溶性色素粗品總類胡蘿卜素含量的測定

菠蘿皮油溶性色素粗品1 g，用石油醚溶解定容至100 mL，稀釋合適倍數(shù)測定在（440±10）nm波長下溶液的最大吸光度A[21-22]。

1.2.5.4 菠蘿皮水溶性色素粗品和黃酮粗品總黃酮含量的測定

采用蘆丁標準品繪制標準曲線，用最小二乘法作線性回歸得蘆丁濃度(X)與吸光度(Y)的關系曲線的回歸方程式：Y=0.0118X-0.0098，R2=0.9992。精確稱量菠蘿皮水溶性色素粗品1.0009 g，用純水溶解并定容至100 mL，取4 mL，以不加鋁鹽試劑管為空白，測定總黃酮含量[23]。精確稱量菠蘿皮黃酮粗品0.1004 g，用60%乙醇溶解定容至100 mL，抽濾過濾后，取2 mL，后續(xù)操作同上。

2 結果與分析

2.1 溶劑法提取干菠蘿皮色素工藝條件的確定

通過單因素和正交優(yōu)化試驗考察各因素對浸提色素量的影響，結果略，確定溶劑法提取菠蘿皮干粉色素的優(yōu)化工藝為浸提溶劑80%乙醇，料液比1∶50(g/mL)，水浴溫度70℃，破碎度過10目，浸提級數(shù)2級，1級浸提時間80 min，2級浸提時間40 min。

2.2 溶劑法提取新鮮菠蘿皮色素工藝條件的確定

通過單因素和正交優(yōu)化試驗考察各因素對浸提色素量的影響，結果略，確定溶劑法提取新鮮菠蘿皮色素的優(yōu)化工藝為浸提溶劑90%乙醇，料液比1∶9(g/mL)，水浴溫度60℃，浸提級數(shù)2級，1級浸提時間2 h，2級浸提時間0.5 h。

2.3 菠蘿皮干粉和鮮皮色素浸提工藝路線的比較

菠蘿皮干粉和鮮皮色素浸提工藝路線的比較結果見表1。

表1 菠蘿皮干粉和鮮皮色素浸提工藝條件的比較Table 1 Contrast of extraction process of both fresh and dry pineapple peel

試驗測得菠蘿皮干粉的水分含量為11.77%，破碎后的新鮮菠蘿皮水分含量為88.93%。

從表1可以看出對于相等干物質量的菠蘿皮干粉和鮮皮，干粉色素浸提工藝與鮮皮色素浸提工藝相比：95%乙醇消耗量較小，浸提時間較短，但浸提水浴溫度較高，且原料需干燥。從工藝角度，2條工藝路線各有優(yōu)劣。

從浸提色素產品角度，油溶性色素溶液二者均為金黃色，色澤相近；水溶性色素溶液干粉為淺橙色，鮮皮為極淺的橙色，顏色差別明顯。由此可知若需同時提取油溶性和水溶性色素，或以水溶性色素為主要產品，則宜采用干粉色素浸提工藝；若以油溶性色素為主要產品，則2條工藝都可以。本研究以獲得油溶性和水溶性色素產品為目標，故采用干粉色素浸提工藝。

2.4 菠蘿皮干粉色素浸提工藝的響應面優(yōu)化

Box-Benhnken響應面設計方案及結果見表及組圖1和2。經回歸擬合后，得到以浸提色素量Ⅰ（即A323×10×V，式中：V為浸提濾液體積）為響應值的回歸方程為：

以浸提色素量Ⅱ（即A421.1×V）為響應值的回歸方程為：

浸提色素量Ⅰ對應的方差分析結果見表2。

表2 方差分析表（對應浸提色素量Ⅰ）Table 2 Analysis of variance table[Partial sum of squares-Type III](corresponding to pigmentⅠ)

續(xù)表2 方差分析表（對應浸提色素量Ⅰ）Continue table 2 Analysis of variance table[Partial sum of squares-Type III](corresponding to pigmentⅠ)

由表2可以看出對于浸提色素量Ⅰ，從模型和失擬兩項可以得出該二次多項響應面模型非常適合。此外，各因素對浸提色素量Ⅰ影響的顯著性為：浸提水浴溫度影響極顯著，料液比和浸提時間影響顯著，乙醇濃度影響不顯著。

各因素及其交互作用對浸提色素量Ⅰ的影響見圖1。

圖1 各因素及其交互作用對浸提色素量Ⅰ的影響Fig.1 The effect of factors and their interaction on extraction of pigmentⅠ

表3 方差分析表（對應浸提色素量Ⅱ）Table 3 Analysis of variance table[Partial sum of squares-Type III](corresponding to pigmentⅡ)

從圖1可以分析得出，隨乙醇濃度(A)的增大，浸提色素量Ⅰ呈先增大后減小的趨勢，其余三因素，浸提色素量Ⅰ均隨因素值的增大而增大，其中增大幅度：水浴溫度(C)＞料液比(B)＞浸提時間(D)。此外還可分析得出乙醇濃度(A)與料液比(B)交互作用明顯，乙醇濃度(A)與水浴溫度(C)交互作用明顯，料液比(B)與水浴溫度(C)交互作用明顯，其余各因素間交互作用不明顯。

浸提色素量Ⅱ對應的方差分析結果見表3。

從表3可以看出對于浸提色素量Ⅱ，從模型和失擬兩項可以得出該二次多項響應面模型非常適合。此外，各因素對浸提色素量Ⅱ影響的顯著性為：乙醇濃度和浸提水浴溫度影響極顯著，料液比和浸提時間影響顯著。

各因素及其交互作用對浸提色素量Ⅱ的影響見圖2。

從圖2可以分析得出，對于乙醇濃度(A)、料液比(B)、水浴溫度(C)和浸提時間(D)四因素，浸提色素量Ⅱ均隨各因素值的增大而增大，其中增大幅度：水浴溫度(C)＞ 乙醇濃度(A)＞料液比(B)＞浸提時間(D)。此外從各圖還可分析得出乙醇濃度(A)與料液比(B)、乙醇濃度(A)與水浴溫度(C)、料液比(B)與水浴溫度(C)因素間兩兩交互作用明顯，其余各因素間交互作用不明顯。

采用SAS 8.0對響應面數(shù)據(jù)進行分析預測，對于浸 提 色 素 量 Ⅰ ，X1=70.636850，X2=31.324190，X3=54.240989，X4=51.799546，預測值 Y1=126.416852；對于浸提色素量Ⅱ，X1=95.029002，X2=76.899324，X3=95.959526，X4=189.008345，預測值 Y2=19.158497。

對2組數(shù)據(jù)進行分析權衡，并結合響應面結果，確定 X1=75.00，X2=60.00，X3=70.00，X4=120.00，即乙醇濃度75%，料液比1∶60(g/mL)，水浴溫度70℃，浸提時間120 min，采用Design Expert 7.0分析得出預測值Y1=190.4500，Y2=15.9001。

對優(yōu)化的工藝進行驗證。過10目的菠蘿皮粉0.5 g，75%乙醇 30 mL，70℃水浴，浸提 2 h，放冷 0.5 h后過濾。測定稀釋10倍的濾液在323 nm、421.1 nm處的吸光度和體積，結果見表4。

表4 響應面優(yōu)化工藝條件驗證結果Table 4 Verification result of the response surface optimization

由表4可以看出驗證結果與預測值非常接近，說明預測結果可靠，工藝參數(shù)可行。二級浸提時間與浸提色素量關系見表5。

表5 二級浸提時間與浸提色素量關系表Table 5 The effect of time of extraction cycle 2 on extraction of pigment

由表5可以看出，在其余條件與1級浸提相同的條件下，2級浸提時間完全可以縮短為0.5 h。

由此確定溶劑法提取菠蘿皮干粉色素的最終優(yōu)化工藝為浸提溶劑75%乙醇，料液比1∶60(g/mL)，水浴溫度70℃，破碎度過10目，浸提級數(shù)2級，1級浸提時間2 h，2級浸提時間0.5 h。

通過對比正交優(yōu)化和響應面優(yōu)化，可知這2種優(yōu)化方法各有優(yōu)劣，正交優(yōu)化簡單快速，試驗耗材少，但無法獲得精確的優(yōu)化工藝參數(shù)且通常忽略因素間的交互作用；響應面優(yōu)化可以很好的反應各因素與響應值的關系及各因素交互作用，借用其他統(tǒng)計軟件還可精確預測最優(yōu)工藝參數(shù)及對應響應值，但其操作較為繁瑣，試驗耗材大。在實際應用中可根據(jù)需求采取相應的優(yōu)化方法。

2.5 菠蘿皮色素粗品色價和主要顯色成分含量

過10目的菠蘿皮粉25 g可得菠蘿皮油溶性色素粗品約0.35 g；菠蘿皮水溶性色素粗品約10.5 g；菠蘿皮黃酮粗品約0.30 g。經測定，菠蘿皮油溶性色素粗品色價E1%1cm415 nm為9.031；菠蘿皮水溶性色素粗品色價E1%1cm280 nm為7.413；菠蘿皮油溶性色素粗品總類胡蘿卜素含量為3.149 mg/g；菠蘿皮水溶性色素粗品總黃酮含量為2.451 mg/g；菠蘿皮黃酮粗品總黃酮含量為245.966 mg/g。

3 結論

1）通過單因素和正交優(yōu)化試驗確定溶劑法提取菠蘿皮干粉色素的優(yōu)化工藝為浸提溶劑80%乙醇，料液比1∶50(g/mL)，浸提溫度70℃，破碎度過10目，浸提級數(shù)2級，1級浸提時間80 min，2級浸提時間40 min。

2）通過單因素和正交優(yōu)化試驗確定溶劑法提取新鮮菠蘿皮色素的優(yōu)化工藝為浸提溶劑90%乙醇，料液比1∶9(g/mL)，浸提溫度60℃，浸提級數(shù) 2級，1級浸提時間2 h，2級浸提時間0.5 h。

3）對比上述2條工藝路線得出：若需同時提取油溶性和水溶性色素，或以水溶性色素為主要產品，則宜采用干粉色素浸提工藝；若以油溶性色素為主要產品，則2條工藝都可以。本研究以獲得油溶性和水溶性色素產品為目標，故采用干粉色素浸提工藝。

4）采用響應面優(yōu)化菠蘿皮干粉色素浸提工藝，確定最終優(yōu)化工藝為浸提溶劑75%乙醇，料液比1∶60(g/mL)，浸提溫度70℃，破碎度過10目，浸提級數(shù)2級，1級浸提時間2 h，2級浸提時間0.5 h。正交優(yōu)化和響應面優(yōu)化這2種優(yōu)化方法各有優(yōu)劣，在實際應用中可根據(jù)需求采取相應的優(yōu)化方法。

5）測得菠蘿皮油溶性色素粗品色價E1%1cm415 nm為9.031，其總類胡蘿卜素含量為3.149 mg/g；菠蘿皮水溶性色素粗品色價E1%1cm280 nm為7.413，其總黃酮含量為2.451 mg/g；菠蘿皮黃酮粗品總黃酮含量為245.966 mg/g。

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Optimization of Extraction Technology of Pineapple Peel Pigment by Response Surface Methodology

LIU Ming-shou，CHEN Fa-he*，WU Guang-bin
（College of Bio－ Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，F(xiàn)ujian,China）

2009-09-27

集美大學創(chuàng)新團隊基金（C19002）

劉明綬（1985—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：農產品貯藏加工技術。

*通信作者