廖曉峰，于榮

（東華理工大學(xué)，江西撫州344000）

小龍蝦殼中生物蛋白鈣提取工藝

廖曉峰，于榮

（東華理工大學(xué)，江西撫州344000）

采用小龍蝦蝦殼作為原料，用胰蛋白酶水解法提取生物蛋白鈣，正交試驗(yàn)結(jié)果表明：酶解在pH=7.0,溫度為50℃，加酶量為1%，酶解時(shí)間為2 h的條件下進(jìn)行，提取率達(dá)26.6%。利用紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，用原子吸收法測(cè)定鈣的含量，產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量可達(dá)27.5%，鈣的含量為5.8%，產(chǎn)品可作為高級(jí)飼料及補(bǔ)鈣制劑，同時(shí)變廢為寶，促進(jìn)小龍蝦養(yǎng)殖與加工業(yè)的發(fā)展。

小龍蝦；蛋白鈣；紫外分光光度法；原子吸收分光光法

Abstract：The experimental use of shrimp shell as a raw material extraction,hydrolysis by trypsin extracts of biological protein calcium,the most suitable extraction conditions of pH=7.0,temperature of 50℃,plus 1%of enzyme,digestion time of 2 h conditions,extraction efficiency 26.6%.The use of UV 215 nm and 225 nm in the difference of protein content calculated.At the same time,determined by atomic absorption of calcium content,the process is simple,after extraction by up to 27.5%protein content,calcium content was 5.8%.The promotion of new types of calcium have a more far-reaching significance,while at the same time can achieve the effect of recycling.

Key words:shrimp;biological protein calcium;UV spectrophotometer;atomic absorption spectrophotometer

小龍蝦，學(xué)名“克氏螯蝦”，屬甲殼綱河蝦類，形狀似龍蝦而小，所以又稱小龍蝦?？耸向r的營養(yǎng)成分和海蝦相當(dāng)，蝦體內(nèi)含的都是高蛋白、低脂肪，蛋白含量占總體的16%~20%左右，脂肪含量不到0.2%。而且所含的脂肪主要是由不飽合脂肪酸組成的，易于人體吸收。蝦肉內(nèi)鋅、碘、硒等微量元素的含量要高于其它食品，同時(shí)，它的肌纖維細(xì)嫩，易于消化吸收。

龍蝦不僅是肉質(zhì)潔白細(xì)嫩，味道鮮美，高蛋白，低脂肪，營養(yǎng)豐富。龍蝦還有藥用價(jià)值，能化痰止咳，促進(jìn)手術(shù)后的傷口生肌愈合。

我國克氏螯蝦主要分布在江蘇、湖北、江西、安徽等長江中下游地區(qū)，生長在江、河、湖泊等水體中，資量在6萬t以上。

廢棄蝦殼可用來生產(chǎn)生物蛋白鈣。人體中的鈣元素主要以羥基磷酸鈣晶體的形式存在于骨骼和牙齒中。身體中的礦物質(zhì)約占體重的5%，鈣約占體重的2%。身體的鈣大多分布在骨骼和牙齒中，約占總量的99%，其余1%分布在血液、細(xì)胞間液及軟組織中。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

CL-3型恒溫加熱磁力攪拌器、SHZ-DC（III）循環(huán)水式真空泵：鞏玉市予黃儀器有限公司；BS223S分析天平：北京賽多利斯儀器有限公司；UV751GD紫外分光光度計(jì)、WFX-120原子吸收分光光計(jì)計(jì)：北京瑞麗光學(xué)儀器廠。

1.1.2 原料及試劑

蝦頭：選取新鮮無腐敗的蝦頭作原料；氫氧化鈉：30%NaOH；胰蛋白酶：要求酶活20萬U/g以上。

1.2 制備工藝

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作步驟

1.2.2.1 預(yù)處理

蝦頭殼經(jīng)分檢、去雜后,浸入50℃溫水10 min,去除部分蝦鮮味,撈取蝦頭殼,用清水反復(fù)沖洗至無浮液并瀝干待用。

1.2.2.2 烘干

將清洗好的蝦頭殼置于鼓風(fēng)干燥箱中干燥，干燥溫度為70℃，時(shí)間6 h。

1.2.2.3 粉碎、均質(zhì)

對(duì)達(dá)到干燥要求的蝦頭殼，先用搗碎機(jī)搗碎，后用研缽將大塊的研碎。再加入5倍的蒸餾水調(diào)勻，均質(zhì)機(jī)均質(zhì)1 h，收集蝦頭殼料液。

1.2.2.4 酶解

將均質(zhì)后的料液放入玻璃容器里，在恒溫?cái)嚢杵魃项A(yù)熱至50℃，用30%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH7.0~9.0左右，再按1%~2.5%投料量將胰蛋白酶投入，恒溫45℃左右，在攪拌器攪拌的條件下反應(yīng)，然后加熱至80℃（5 min）,酶解完畢。

1.2.2.5 噴霧干燥

將酶解完的酶解液酶解后的料液在空氣壓力0.3 MPa，進(jìn)口溫度150℃，出口溫度70℃工藝條件下進(jìn)行噴霧干燥，即得成品。

1.3 蛋白質(zhì)測(cè)定方法

采用215 nm和225 nm的吸收差法測(cè)定酶解液中蛋白質(zhì)含量，因蛋白質(zhì)的肽鍵在200 nm~250 nm有強(qiáng)的紫外光吸收，其光吸收強(qiáng)弱在一定范圍內(nèi)與濃度成正比，且波長越短光吸收越強(qiáng)。若選取215 nm可減少干擾及光散射，用215 nm和225 nm光吸收差值與單一波長測(cè)定相比，可減少非蛋白質(zhì)成分引起的誤差。因此，對(duì)酶解液中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定可用215 nm和225 nm光吸收差法。計(jì)算采用下列經(jīng)驗(yàn)公式

測(cè)定范圍為 20 μg~100 μg蛋白質(zhì)/mL。

2 結(jié)果討論

2.1 提取條件的單因素試驗(yàn)

2.1.1 加酶量對(duì)提取過程的影響

將烘干后的蝦殼粉稱取1 g，加入5 mL水研磨，后按1%、1.5%、2%、2.5%投料量將胰蛋白酶投入，恒溫50℃，反應(yīng)時(shí)間為30 min,將pH調(diào)節(jié)到7.0的條件下進(jìn)行酶解。結(jié)果如表1、圖1所示。

表1 加酶量對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Table 1 Increase the amount of enzyme extraction rate of protein

圖1 加酶量對(duì)提取率的影響Fig.1 Increase the amount of enzyme extraction rate of protein

由圖1可看出，隨著加酶量的增加，蛋白質(zhì)的提取率在不斷的下降，在加酶量為1%時(shí)蛋白質(zhì)的提取率最高。

2.1.2 溫度對(duì)提取過程的影響

將烘干后的蝦殼粉稱取1 g，加入5 mL水研磨，后按2.1.1的最佳結(jié)果1%投料量將胰蛋白酶投入，恒溫45、50、55、60℃,反應(yīng)時(shí)間為30 min,將pH調(diào)節(jié)到7.0的條件下進(jìn)行酶解。結(jié)果如表2、圖2所示。

表2 溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Table 2 Temperature on the extraction rate of protern

圖2 溫度對(duì)提取率的影響Fig.2 Temperature on the extraction rate of protein

由圖2可以看出當(dāng)溫度為50℃時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率最大，溫度再升高，酶活性減少，隨之蛋白質(zhì)的提取率下降。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)提取過程的影響

將烘干后的蝦殼粉稱取1 g，加入5 mL水研磨，后按2.1.1的最佳結(jié)果1%投料量將胰蛋白酶投入，恒溫50℃(2.1.2的最佳結(jié)果),反應(yīng)時(shí)間為 0.5、1.5、2、3 h,將pH調(diào)節(jié)到7.0的條件下進(jìn)行酶解。結(jié)果如表3、圖3所示。

表3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Table 3 Reaction time on the extraction rate of protern

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.3 Reaction time on the extraction rate of protein

由圖3可看出當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到2 h時(shí)酶解基本完全，這時(shí)的提取率最高。

2.1.4 pH值對(duì)提取過程的影響

將烘干后的蝦殼粉稱取1 g，加入5 mL水研磨，后按2.1.1的最佳結(jié)果1%投料量將胰蛋白酶投入，恒溫50℃(2.1.2的最佳結(jié)果),反應(yīng)時(shí)間為2 h,將pH調(diào)節(jié)到7.0、8.0、9.0的條件下進(jìn)行酶解。結(jié)果如表4、圖4所示。

表4 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Teble 4 pH vaule on the extraction rate of protein

由圖4可看出pH值在9.0時(shí)蛋白質(zhì)的提取率最大，隨著pH值的增大酶失去活性。

2.2 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)見表5、表6。

從表6可看出：極差值R為因素A(0.25)、B(0.33)、C(0.26)，故影響提取蛋白質(zhì)的因素的主次關(guān)系為B(反應(yīng)溫度)>C(pH值)>A(反應(yīng)時(shí)間)。

最佳工藝組合是：A2B2C1(即反應(yīng)時(shí)間為2 h，反應(yīng)溫度 50℃，pH=7.0)。

圖4 pH值對(duì)提取率的影響Fig.4 pH value on the extraction rate of protein

表5 正交試驗(yàn)因素水平表Table 5 Orthogonal experimental design

表6 正交試驗(yàn)Table 6 Orthogonal experiment

2.3 鈣含量的測(cè)定

生物蛋白鈣產(chǎn)品中除蛋白質(zhì)含量外，鈣含量也是一個(gè)重要指標(biāo)，為此采用原子吸收法測(cè)定產(chǎn)品中鈣的含量。

2.3.1 原理

樣品經(jīng)濕法消化后，導(dǎo)入原子吸收分光光度計(jì)中，經(jīng)火焰原子化后，吸收422.7 nm的共振線，其吸收量與含量成正比，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。

2.3.2 試劑

去離子水，優(yōu)級(jí)純?cè)噭换旌纤嵯海合跛崤c高氯酸比為4∶1；0.5 mol/L硝酸溶液：量取45 mL硝酸，加去離子水并稀釋至1000 mL；2%氧化鑭溶液：稱取25 g氧化鑭（純度大于99.99%），加75 mL鹽酸于1000 mL容量瓶中，加去離子水稀釋至刻度；鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取1.2486 g碳酸鈣（純度大于99.99%),加50 mL去離子水，加鹽酸溶解，移入1000 mL容量瓶中，加2%氧化鑭稀釋至刻度。貯存于聚乙烯瓶內(nèi)，4℃保存。此溶液每毫升相當(dāng)于500 μg鈣。

鈣標(biāo)準(zhǔn)使用液：鈣標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制見表7。

表7 鈣標(biāo)準(zhǔn)使用液Table 7 Ca standard processed liquid

鈣標(biāo)準(zhǔn)使用液配制后，貯存于聚乙烯瓶內(nèi)，4℃保存。

將鈣標(biāo)準(zhǔn)使用液分別配制不同濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，見表8。

表8 不同濃度系列標(biāo)準(zhǔn)稀釋液Table 8 Ca standard dilution liquid

2.3.3 測(cè)定參數(shù)

測(cè)定操作參數(shù)見表9。

表9 測(cè)定操作參數(shù)Table 9 Test operating parameter

其他試驗(yàn)條件：儀器狹縫(0.2 mm)、空氣及乙炔的流量、燈頭高度、元素?zé)綦娏?3 mA)等均調(diào)至最佳狀態(tài)。

將消化好的樣液、試劑空白液和各元素的標(biāo)準(zhǔn)濃度系列分別導(dǎo)入原子吸收分光光度計(jì)，用火焰進(jìn)行測(cè)定。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以各濃度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液與對(duì)應(yīng)的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。

它的線性相關(guān)系數(shù)為1。濃度單位為μg/mL,則得樣品液及空白液由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出濃度值（c及c0），再按式（1）計(jì)算。

圖5 鈣離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standardy curve of caluiumionic

式中：X 為樣品中元素的含量，（mg/100 g）；c為測(cè)定用樣品中元素的濃度（由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出），(μg/mL)；c0為試劑空白液中元素的濃度（由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出），(μg/mL)；V為樣品定容體積，mL；f為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量；1000為折算成每百克樣品中元素的含量，以mg計(jì)。

2.3.5 樣品測(cè)定

將所酶解的酶解液定容至50 mL，從中取1 mL稀釋至10 mL，用原子吸收法測(cè)定鈣離子，所得數(shù)據(jù)如表10。

表10 樣品測(cè)定結(jié)果Table 10 The determination results of sample

由表10數(shù)據(jù)可以得出鈣的含量為8.4 mg/g。人體每天所需鈣的量為800 mg/d，所以100 g的蝦殼廢料生產(chǎn)生物蛋白鈣就可以補(bǔ)充人體1 d所需的鈣量。

3 結(jié)論

小龍蝦的蝦頭、蝦殼是一種廉價(jià)的可再生資源,從蝦頭、蝦殼中提取生物蛋白鈣有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。采用小龍蝦蝦殼作為原料，用胰蛋白酶水解法提取生物蛋白鈣，正交試驗(yàn)結(jié)果表明：酶解在pH=7.0,溫度為50℃，加酶量為1%，酶解時(shí)間為2 h的條件下進(jìn)行,提取率達(dá)26.6%。利用紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量可達(dá)27.5%，用原子吸收法測(cè)定鈣的含量，鈣的含量為5.8%，鈣的含量也非常高，并且是生物鈣，有利人體的吸收。生產(chǎn)工藝不是很復(fù)雜，小投資就可使蝦頭、蝦殼變廢為寶,可作為高級(jí)飼料和補(bǔ)鈣制劑，創(chuàng)造良好的經(jīng)濟(jì)效益。

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Extraction Process on Biological Protein Calcium of Shrimp Shell

LIAO Xiao-feng,YU Rong
（East China Institute of Technology，F(xiàn)uzhou 344000,Jiangxi,China）

2009-09-11

廖曉峰（1965—），男（漢），教授，博士，從事食品研究與開發(fā)。