溫東，魏旋，徐保明，*

（1.蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，河北唐山064000；2.湖北工業(yè)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢430068）

不同的處理方法制取姜汁對(duì)生姜蛋白酶的影響

溫東1，魏旋2，徐保明2，*

（1.蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，河北唐山064000；2.湖北工業(yè)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢430068）

以新鮮的老生姜為原料，采用閃式提取法、重力壓榨提取法和超聲波輔助重力壓榨提取法榨取姜汁，測(cè)定姜汁中蛋白酶的活力，確定超聲波輔助重力壓榨提取法為最優(yōu)方法。并確定超聲波輔助處理時(shí)料液質(zhì)量比為1∶3，超聲處理時(shí)間為15 min，超聲功率為250 W。

生姜；生姜蛋白酶；酶活力

Abstract：The old fresh ginger as the raw material,using flash-type extraction method,squeezing gravityassisted extraction and ultrasonic extraction method to extract ginger juice to measure the protease activity in ginger,Ultrasound-assisted gravity to determine the best method.And determine the ultrasonic-assisted processing parameter:material to liquid weight ratio is 1∶3,ultrasonic processing time is 15 min,ultrasonic power is 250 W.

Key words:ginger;ginger protease;enzyme activity

姜是重要的藥食兩用物質(zhì)，其中含有多種有用成分，如生姜多糖、姜精油、姜油樹脂、生姜蛋白酶等。生姜撞奶又稱生姜凝乳，是我國(guó)傳統(tǒng)的乳制品之一，具有悠久的歷史，起源于我國(guó)廣東省南海縣平洲和番禺縣沙灣。張平平等[1]用姜汁、生姜蛋白酶粗提物和揮發(fā)油分別進(jìn)行了凝乳試驗(yàn)，得到姜汁中起凝乳作用的物質(zhì)是生姜蛋白酶。

生姜蛋白酶是從生姜根莖中提取的一種酶，它是蛋白水解酶之一，是一種巰基蛋白水解酶類，具有蛋白酶和膠原蛋白酶雙重性質(zhì)[2]。有研究表明生姜蛋白酶的分子量大約30000 u左右，通過(guò)DEAE-纖維素層析柱對(duì)該酶進(jìn)行純化，證明該酶是由兩個(gè)組分組成，最適pH為6.5~7.0，巰基化合物為激活劑，等電點(diǎn)分別為7.0和8.0，并鑒定這兩種酶均為糖蛋白，證實(shí)糖肽型均為非O-型，純化酶的結(jié)晶為六面體[3]。提取生姜蛋白酶首先要得到姜汁，姜汁的制備方法對(duì)生姜蛋白酶的活力和提取率有很大的影響。本試驗(yàn)旨在研究不同的處理方法制取姜汁對(duì)生姜蛋白酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

生姜：購(gòu)于市場(chǎng)；牛血清白蛋白：上海泊奧生物科技有限公司；L-酪氨酸、酪蛋白：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸：天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；NaCl：中國(guó)堯舜進(jìn)出口有限公司；考馬思亮藍(lán)G-250：上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站進(jìn)口分裝；三氯乙酸：天津巴斯夫化工有限公司；蒸餾水：自制。

Spectrumlab 755s紫外可見分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；FA-N/JA-N電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：城西曉陽(yáng)電子儀器廠；JHBE-50A閃式提取器：北京金鼎科技發(fā)展有限公司；超聲波藥品處理機(jī)：濟(jì)寧金百特電子有限責(zé)任公司。

1.2 分析方法

1.2.1 考馬思亮藍(lán)G-250法測(cè)定生姜蛋白酶提取率[4]

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，用0.15mol/LNaCl溶解并配置不同濃度的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別加入1 mL不同濃度的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液和5 mL考馬思亮藍(lán)G-250溶液于比色管中。以加入1 mL 100 μg/mL牛血清白蛋白溶液和5 mL考馬思亮藍(lán)G-250溶液的比色管作為空白樣。用紫外分光光度計(jì)于595nm下測(cè)定各比色管內(nèi)溶液的吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protein concentration

取適量的不同方法制備得到的姜汁溶液和5 mL考馬思亮藍(lán)G-250溶液于比色管中，用紫外分光光度計(jì)于595 nm下測(cè)定吸光度，所得吸光度要保證在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)。根據(jù)標(biāo)曲將吸光度轉(zhuǎn)換為生姜蛋白酶的量再按式（1）計(jì)算生姜蛋白酶在生姜中的含量：

式中：Y為生姜蛋白酶的提取率，%；A為反應(yīng)物吸光度在酶含量標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的酶溶液濃度，（μg/mL）；B 為姜汁總量，mL；C 為所用生姜的重量，μg；N為姜汁稀釋倍數(shù)。

1.2.2 酪蛋白消化法測(cè)定生姜蛋白酶活力[5]

以L-酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1 mol/L HCl溶液溶解并配置不同濃度的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取10mL不同濃度的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以0.1 mol/L HCl溶液作為空白樣，用紫外分光光度計(jì)于275 nm下測(cè)定各溶液的吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 酶活力測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of enzyme activity

分別精密量取不同方法制備得到的姜汁溶液適量，激活劑溶液1 mL，40℃水浴預(yù)熱10 min，加入已預(yù)熱至40℃的酪蛋白溶液5 mL，搖勻，立即置入40℃水浴中，開始計(jì)時(shí)。恒溫水浴中振蕩反應(yīng)后精密加入55%AcCl3溶液5 mL終止反應(yīng)，混勻，離心取上清液。以0.1 mol/L HCl溶液作為空白樣，用紫外分光光度計(jì)于275 nm下測(cè)定各溶液的吸光度。根據(jù)標(biāo)曲將吸光度轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)-酪氨酸的濃度，再按式（2）計(jì)算生姜蛋白酶活力：

式中：U為生姜蛋白酶活力；A為根據(jù)標(biāo)曲將吸光度轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)-酪氨酸的濃度，（μg/mL）；N為姜汁稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間，h。

按式（3）計(jì)算生姜蛋白酶比酶活力P；

式中：P 為姜蛋白酶比酶活力，（U/μg）；C為蛋白酶質(zhì)量，μg。

1.3 試驗(yàn)方法

取相同質(zhì)量的新鮮老姜3份，洗凈、切片，加入適量純水，分別采用閃式提取法、重力壓榨提取法和超聲波輔助重力壓榨提取法提取姜汁。改變超聲波助提取時(shí)的料液比(質(zhì)量比)、超聲時(shí)間和超聲功率，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，將不同方法得到的姜汁按1.2所述分析方法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對(duì)姜汁中蛋白酶的影響

閃式提取法、重力壓榨提取法和超聲波輔助重力壓榨提取法對(duì)姜汁中蛋白酶的影響見表1。

表1 不同提取方法對(duì)姜汁中蛋白酶的影響Table 1 The influence of ginger protease with different extraction methods

根據(jù)表1可以看出閃式提取法的蛋白酶提取率最高，其次為超聲波輔助重力壓榨提取法，但酶活力最高的是重力壓榨提取法，其次為超聲波輔助重力壓榨提取法。這可能是因?yàn)殚W式提取法可將細(xì)胞完全打破，這樣更利于生姜蛋白酶的提取，但生姜蛋白酶是一種敏感性物質(zhì)，溫度過(guò)高、剪切力過(guò)大都可能造成蛋白酶的失活，而閃式提取設(shè)備粉碎漿的高速旋轉(zhuǎn)都會(huì)造成溫度過(guò)高、剪切力過(guò)大，從而造成蛋白酶的活力降低。超聲波輔助重力壓榨提取法中超聲波的獨(dú)特的機(jī)械振動(dòng)和空化作用伴隨著強(qiáng)大的沖擊波和微聲流，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使蛋白酶更易提出而不破壞生姜蛋白酶的活力。綜上所述，選用超聲波輔助重力壓榨提取法有利于得到高活性的生姜蛋白酶，并提高了生姜蛋白酶的提取率。

2.2 不同料液比對(duì)姜汁中蛋白酶的影響

采用超聲波輔助重力壓榨提取法，用不同的料液比（質(zhì)量比）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 不同料液比（質(zhì)量比）對(duì)姜汁中蛋白酶的影響Table 2 The influence of ginger protease with different solidliquid ratio（weight ratio）

根據(jù)表2可以看出料液比（質(zhì)量比）對(duì)蛋白酶的提取率有影響，隨著加水量的增加提取率也隨之增加，對(duì)酶的活力影響不大。這可能是因?yàn)樯鞍酌傅奶崛∵^(guò)程是以擴(kuò)散傳質(zhì)為基礎(chǔ)，用適當(dāng)?shù)乃畬⑸械牡鞍酌赣晒滔噢D(zhuǎn)移至液相，得到含生姜蛋白酶的提取液，是一個(gè)固液提取過(guò)程。水量增加，料液之間的濃度差增大，有利于傳質(zhì)過(guò)程的進(jìn)行，從而提高生姜蛋白酶的提取率。但當(dāng)加水量過(guò)大時(shí)，溶液中生姜蛋白酶的濃度會(huì)過(guò)低，會(huì)造成后續(xù)濃縮工作的負(fù)擔(dān)。

2.3 不同超聲時(shí)間對(duì)姜汁中蛋白酶的影響

采用超聲波輔助重力壓榨提取法，用不同的超聲時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 不同超聲時(shí)間對(duì)姜汁中蛋白酶的影響Table 3 The influence of ginger protease with different ultrasonic time

根據(jù)表3可知，超聲處理時(shí)間延長(zhǎng)有利于生姜蛋白酶的提取，但生姜蛋白酶的活力隨超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后下降。這可能是因?yàn)樯鞍酌甘菬崦粜晕镔|(zhì)，延長(zhǎng)超聲處理時(shí)間會(huì)造成局部溫度過(guò)高，從而破壞了生姜蛋白酶的活性。

3.4 不同超聲功率對(duì)姜汁中蛋白酶的影響

采用超聲波輔助重力壓榨提取法，用不同的超聲功率進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 不同超聲功率對(duì)姜汁中蛋白酶的影響Table 4 The influence of ginger protease with different ultrasonic powe

根據(jù)表4可知超聲功率增加有利于生姜蛋白酶的提取，但隨著超聲功率的增加生姜蛋白酶的活力先增加，當(dāng)功率高于250 W后，蛋白酶的活力開始下降。這可能是因?yàn)樯鞍酌笇?duì)熱敏感，超聲功率過(guò)高會(huì)造成局部溫度過(guò)高，從而使生姜蛋白酶失活。

4 結(jié)論

1）溫度和剪切力都會(huì)對(duì)生姜蛋白酶的活力產(chǎn)生影響，選用超聲波輔助重力壓榨提取法有利于得到高活性的生姜蛋白酶，并提高了生姜蛋白酶的提取率。提取率為0.933%，活力為190 U。

2）采用超聲波輔助重力壓榨提取法，料液比為1∶3時(shí)，有利于蛋白酶的提取，且不會(huì)對(duì)后續(xù)的濃縮工作造成負(fù)擔(dān)。提取率為0.935%，活力為190 U。

3）采用超聲波輔助重力壓榨提取法，超聲處理時(shí)間為15 min時(shí)，有利于生姜蛋白酶的提取，且不會(huì)破壞蛋白酶的活性。提取率為0.897%，活力為190 U。

4）采用超聲波輔助重力壓榨提取法，超聲功率為250 W時(shí)，有利于生姜蛋白酶的提取，且不會(huì)因局部溫度過(guò)高而影響蛋白酶的活力。提取率為0.911%，活力為192 U。

[1]張平平,黃雪松,劉憲華.姜汁凝乳的研究[J].中國(guó)乳品工業(yè),1999,27(5):17-19

[2]曾劍超.姜汁凝乳機(jī)理的探討[D].西華大學(xué),20084:8-9

[3]代景泉.生姜蛋白酶的分離純化及其部分特性的研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2002(5):5-7

[4]韓雅珊.食品化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1992:57-62

[5]周惠,魯治斌,齊杰,等.蛋白水解酶活力測(cè)定新方法[J].生物化學(xué)雜志,1994,10(5):630-632

The Influence of Ginger Protease with Different Ways Extract Liquid from Ginger

WEN Dong1,WEI Xuan2,XU Bao-ming2,*
（1.Mengniu Dairy(Group)Co.,Ltd.,Tangshan 064000，Hebei,China；2.School of Chemical and Environmental Engineering,Hubei University of Technology,Wuhan 430068，Hubei,China）

2010-02-01

溫東（1979—），男（漢），碩士，研究方向：食品加工工藝。

*通信作者：徐保明（1966—），男，高級(jí)工程師，副教授。