楊穎，宋曙輝，王文琪，徐桂花

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750001；2.國家蔬菜工程技術(shù)研究中心，北京100097）

花生殼提取物的三種體外抗氧化方法的綜合比較

楊穎1，2，宋曙輝2，王文琪2，徐桂花1

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750001；2.國家蔬菜工程技術(shù)研究中心，北京100097）

采用DPPH、TBA和Xan-XOD 3種體外評價方法評價花生殼提取物的抗氧化活性，結(jié)果表明，在這3種抗氧化評價體系中，花生殼提取物均顯示了良好的抗氧化性能，DPPH中IC50為7 μg/mL,大豆油中IC50為0.017%，亞麻油中為0.027%，花生油中為1.19%,Xan-XOD中IC50為0.2 mg/mL。

花生殼提取物；木犀草素；DPPH；TBA；Xan-XOD；抗氧化

Abstract:Three different systems including DPPH scavenging method,TBA and Xan-XOD were used to investigate the antioxidant activity of peanut hull extract.The results showed that the extract had high antioxidant activity in these evaluation systems.In DPPH the IC50is the 7 μg/mL,In TBA the IC50is the 0.017%for soybean oil,the 0.027%for linseed oil,the 1.19%for peanut oil,in Xan-XOD the IC50is the 0.2 mg/mL.

Key words：peanut hull extract；Luteolin；DPPH；TBA；Xan-XOD；antioxidant

抗氧化的評價方法有體內(nèi)和體外兩種方法，體內(nèi)評價多采用動物，如大鼠和小鼠進(jìn)行體內(nèi)抗氧化酶類的評價，抗氧化酶一般是取超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等，以及尿酸、谷胱甘肽、VC、類胡蘿卜素、生育酚和輔酶Q10等。體外抗氧化能力的測定方法主要有ABTS法、DPPH法、FRAP法、ORAC法、PCL法等；目前常用來測定抗氧化活性方法的原理主要基于兩類[1]：一是對人工合成自由基的清除（如·OH、超氧陰離子自由基、二苯代苦味酞基自由基等）；二是在特定環(huán)境下，對測試體系中脂類物質(zhì)氧化抑制能力的測定（如：硫氰酸鐵法FTC法、硫代巴比妥酸反應(yīng)物TBARs法）。

花生殼中含有較高的木犀草素。木犀草素作為一種天然黃酮化合物具有抗氧化功能，本研究主要是運用清除DPPH·、·OH及抑制脂質(zhì)過氧化等3種抗氧化評價方法對花生殼提取物的抗氧化能力進(jìn)行評價，使花生殼資源能夠得到更好的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備

離心機：飛鴿牌TDL-40B；分析天平：島津LM-20,百萬分之一；UV-2550紫外分光光度計：日本島津。

1.2 試劑

木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品、二苯代苦味肼基（DPPH）、黃嘌呤（Xanthine）、羥胺（HONH2）、黃嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase,XOD）、對氨基苯磺酸(sulfanilic acid)、萘乙二胺（NED）均購自 Sigma；蘆丁、槲皮素、抗壞血酸、2.6－二叔丁基對甲酚（BHT）、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、三氯甲烷、磷酸鹽緩沖液（PBS：磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、鹽酸、無水乙醇、甲醇均為分析純。

1.3 花生殼提取液的制備

取烘干粉碎的花生殼粉，70%乙醇提取，提取液離心，取上清液備用，其濃度均為溶液中的木犀草素的濃度。

1.4 方法

1.4.1 清除DPPH·的能力測定

1.4.1.1 測定原理

DPPH·在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其結(jié)構(gòu)中含有3個苯環(huán)，1個氮原子上有一個孤對電子，呈現(xiàn)紫色。若受試物能清除它，則表示受試物具有清除自由基的作用，是一種篩選自由基清除劑的簡便方法，國內(nèi)外將其廣泛用于清除自由基的研究[2]。該方法的原理是[3]：DPPH·在517 nm波長處有最強吸收呈深紫色，當(dāng)DPPH·溶液中加入自由基清除劑時，由于與其單電子配對而使溶液顏色變淺，吸收逐漸消失，其退色程度與其所接受的電子數(shù)成線性關(guān)系，因而可用分光法進(jìn)行測量，從而評價試驗樣品的抗氧化能力。

1.4.1.2 測定方法

稱取一定量的DPPH·，配成0.2 mmoL/L的DPPH溶液，于冰箱中冷藏保存，按照表1的方法加入制備好的花生殼提取液測定清除DPPH·的能力。

表1 DPPH·試驗加樣表Table 1 DPPH test plus sample table

式中：A0為雙蒸水與DPPH溶液反應(yīng)的吸光值；A樣：樣品溶液與DPPH溶液反應(yīng)的吸光值；A空：樣品溶液與乙醇溶液反應(yīng)的吸光值。

1.4.2 抗油脂過氧化力的測定[4]

1.4.2.1 測定原理

油脂發(fā)生過氧化反應(yīng)從其化學(xué)本質(zhì)來講,主要是油脂中含有不飽和脂肪酸,尤其是亞油酸和亞麻酸上含有的1,4戊二烯結(jié)構(gòu)使它們對氧化的敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過油酸中丙烯體系,這種氧化作用又受到金屬離子如Fe2+、Cu2+的催化,氧化反應(yīng)一旦被啟動,很容易形成鏈?zhǔn)椒磻?yīng),加速油脂的氧化酸敗?？寡趸瘎┳鳛闅浣o予體和自由基接受體起著抑制鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的作用,從而使油脂過氧化反應(yīng)的發(fā)生受到一定的限制。該方法的原理是[5]：丙二醛是油脂被氧化后的產(chǎn)物,它可以與硫代巴比妥酸反應(yīng)生成有色產(chǎn)物可在532 nm下測定出其吸光值,吸光度值表示油脂氧化程度,其值越大,氧化程度越嚴(yán)重，當(dāng)油脂中加入抗氧化劑時，就會減少氧化反應(yīng)的發(fā)生從而降低丙二醛的含量。

1.4.2.2 測定方法

稱取1 g油樣，加入一定量的花生殼提取物，于烘箱中45℃下恒溫24 h，取烘過的混合油樣1 mL加入2 mL 20%的TCA和2 mL 0.6%的TBA在沸水浴下20 min，取出冷卻后加入5 mL三氯甲烷，充分混勻，離心后取上清液比色，在532 nm下測定其吸光度。按以下公式計算抑制率。

加好樣后搖勻，于室溫下靜置30 min后，分光光度計測定其吸光值。按以下公式計算清除率，并通過軟件計算出IC50值。

式中：A空為以蒸餾水代替樣品不經(jīng)烘箱處理的吸光值；A0為以蒸餾水代替樣品經(jīng)過烘箱處理的吸光值；A為樣品管的吸光度值；A及A0計算時均需分別減去各自平行的空白即A空。

1.4.3 在Xan-XOD系統(tǒng)中的抗氧化力的測定[6]

1.4.3.1 測定原理

以羥胺為指示劑，以黃嘌呤為底物，黃嘌呤氧化酶可產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2-·)和過氧化氫（H2O2），二者可進(jìn)一步反應(yīng)生成羥基自由基（·OH）?！H將鹽酸羥胺氧化生成亞硝酸鹽，后者可通過與對氨基苯磺酸與萘乙二胺的反應(yīng)而被分光光度法檢出。而抗氧化劑可通過抑制XOD酶的活性，或清除O2-·、H2O2、·OH等自由基以及抑制鹽酸羥胺的氧化而減少亞硝酸鹽的生成。

1.4.3.2 測定方法[7-8]

精確配制 0.1 mol/L 的 PBS，pH=7.4，1 mmol/L 的HONH2·HCl,0.5 mmol/L 的 Xanthine,0.04 U/mL XOD。將上述溶液以及稀釋為不同濃度的花生殼提取液按表2依次加入到試管中，37℃下水浴振蕩30 min。取出后取0.3 mL迅速加入0.3 mL 1%sulfanilic acid以及0.3 mL0.02%的NED后在540nm下測定其吸光度。

表2 NH2OH-Xan-XOD試驗加樣表Table 2 NH2OH-Xan-XOD plus sample table experiment

1.5 數(shù)據(jù)分析

每個試樣測定2個平行試驗，結(jié)果取平均值。所有數(shù)據(jù)采用Excel和origin7.5進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 清除DPPH·試驗

清除DPPH·試驗，見圖1。由圖1可知，花生殼提取物清除DPPH·的能力與BHT基本相當(dāng)，低于蘆丁和Vc的清除能力。IC50從小到大依次為：VC的0.5 μg/mL＞蘆丁的 1.45 μg/mL＞花生殼提取物的 7 μg/mL＞BHT 的 10.2 μg/mL。

圖1 花生殼提取物與其它幾種抗氧化劑清除DPPH·的比較Fig.1 Peanut hull extract and several different antioxidants Comparison of Removal DPPH radical

2.2 抗油脂過氧化試驗

2.2.1 花生殼提取物在不同油脂中的抗氧化效果

花生殼提取物在不同油脂中的抗氧化效果見圖2。

圖2 花生殼提取物在不同油脂中的抗氧化效果Fig.2 Anti-oxidant of peanut hull extract effect on different oils and fats

由圖2可知：隨著花生殼提取物添加量的增加，其對油脂過氧化力的抑制率增大，在大豆油和亞麻油中的抑制油脂氧化的能力要強于在花生油中，計算IC50，在大豆油中的有效添加量（抑制50%過氧化反應(yīng)時的添加量）為0.017%，在亞麻油中的為0.027%，在花生油中的為1.19%。由于花生油中的油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸的含量要高于大豆油和亞麻油，所以抑制其氧化的IC50要大于大豆油和亞麻油。

2.2.2 花生殼提取物和BHT在亞麻油體系中的抗氧化比較

花生殼提取物和BHT在亞麻油體系中的抗氧化比較見圖3。

由圖3可知，在亞麻油評價體系中，花生殼提取物抑制能力明顯高于BHT，其IC50分別為0.027%、0.12%。在相同的添加量條件下，花生殼提取物的抑制率平均為BHT的1.5倍。

2.3 NH2OH-Xan-XOD系統(tǒng)抗氧化試驗

花生殼提取物和VC在NH2OH-Xan-XOD系統(tǒng)中的抗氧化能力比較如圖4和圖5所示。

圖3 花生殼提取液和BHT在亞麻油中的抗氧化效果的比較Fig.3 Peanut hull extract and BHT in the antioxidant effects of linseed oil with comparison

圖4 VC在NH2OH-Xan-XOD系統(tǒng)中的抗氧化效果Fig.4 Antioxidant of VCeffect on NH2OH-Xan-XOD system

圖5 花生殼提取物在NH2OH-Xan-XOD系統(tǒng)的抗氧化效果Fig.5 Antioxidant of peanut shell extract effect on NH2OH-Xan-XOD system

由圖4和5可知，花生殼提取物在0.02 mg/mL～0.45 mg/mL范圍內(nèi)亞硝酸鹽的生成明顯減少，即·OH的生成被抑制，其IC50為200μg/mL，VC的為7.85μg/mL，花生殼提取物中因含有其他物質(zhì)或雜質(zhì)等，故清除·OH的能力要低于純品VC。

3 結(jié)論

抗氧化的作用可以通過多種途徑來進(jìn)行評價，不同的評價系統(tǒng)其原理不相同。通過3個抗氧化模型系統(tǒng)對花生殼提取物進(jìn)行評價，包括涉及人工合成的自由基的清除、對·OH的抑制及過氧化產(chǎn)物的抑制等。3種抗氧化方法雖然不能相互比較，但可以反應(yīng)出花生殼提取物在不同體系中的抗氧化作用，如圖6所示。

圖6 花生殼提取物的3種抗氧化方法的綜合比較Fig.6 Comparison with three methods of vitro on antioxidant of peanut hull extract

結(jié)果表明：

1）在清除DPPH·試驗中，花生殼提取物有優(yōu)于BHT的抗氧化效果，其 IC50為7 μg/mL；

2）在抗油脂過氧化試驗中，花生殼提取物均表現(xiàn)出較高的抗氧化能力，在抑制亞麻油脂質(zhì)過氧化試驗中，其抗氧化效果明顯高于BHT，其IC50大豆油中為0.017%，亞麻油中為0.027%，花生油中為1.19%；

3）在NH2OH-Xan-XOD系統(tǒng)中的抗氧化能力試驗中，花生殼提取物的IC50在200 μg/mL，具有清除過氧化氫、超氧自由基和·OH的能力。

花生殼提取物的抗氧化能力與其中所含的木犀草素成正相關(guān)。隨著木犀草素含量的增加，抗氧化的能力增強，由此表明花生殼提取物中主要的抗氧化物質(zhì)為木犀草素。

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The Study in Comprehensive Comparison with Three Methods of Vitro on Antioxidant of Peanut Hull Extract

YANG Ying1，2,SONG Shu-hui2,WANG Wen-qi2,XU Gui-hua1
（1.Agriculture College，Ningxia University,Yinchuan 750001,Ningxia,China；2.National Engineering Research Center for Vegetables,Beijing 100097，China）

2009-09-16

楊穎（1985—），女（漢），在讀研究生，主要從事功能性成分的提取及食品安全檢測方面的研究。