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        牛乳中乳鐵蛋白的分離純化

        2010-09-12 12:07:00肖嵐張振宇王熙辛松林
        食品研究與開發(fā) 2010年11期
        關鍵詞:磷酸鈉牛乳酪蛋白

        肖嵐,張振宇,王熙,辛松林

        (四川烹飪高等??茖W校,四川成都610072)

        牛乳中乳鐵蛋白的分離純化

        肖嵐,張振宇,王熙,辛松林

        (四川烹飪高等??茖W校,四川成都610072)

        采用強陽離子交換色譜梯度洗脫法,對牛乳中的乳鐵蛋白進行分離和純化,并利用SDS-PAGE定性檢測。結果表明:采用強陽離子交換色譜梯度洗脫法可較好地分離提取出乳鐵蛋白,分離出的乳鐵蛋白顯示為單一區(qū)帶,每毫升牛乳能提取乳鐵蛋白0.23 mg,純度為95%。

        乳鐵;分離;純化;牛乳

        Abstract:A gradient elution procedure for isolation and purification of lactoferrin by strong cation exchange chromatography in this paper,and lactoferrin was analyzed qualitatively by SDS-PAGE.The result shows that lactoferrin could be isolated and purificated by strong cation exchange chromatography in this paper,the isolated lactoferrin as a single band in SDS-PAGE,lactoferrin could be obtained 0.23 mg from per milliliter bovine milk and the purity was 95%.

        Key words:lactoferrin;isolation;purification;bovine milk

        乳鐵蛋白(Lactoferrin,LF)是一種相對分子量約為80000 u的鐵結合性糖蛋白,主要存在于乳汁、眼淚、唾液、精液、鼻腔分泌物等外分泌液或血漿、中性粒細胞中。乳汁,尤其是初乳中LF的含量很高,如牛初乳中的LF質量濃度為1 g/L[1]。Groves[2]于1960年首次從牛乳中分離獲得LF,由于LF與鐵結合形成紅色的復合物,故也稱其為“紅蛋白”。LF功能廣泛,具有廣譜抗菌、抗病毒感染作用,能調節(jié)體內鐵平衡,促進骨髓細胞生成,促進細胞生長,增強機體免疫、抗病能力,抑制人體腫瘤細胞作用,能與多種抗生素及抗真菌制劑協(xié)同作用,更有效治療疾病[3-4]。由此可見,乳鐵蛋白可廣泛應用于食品、生化、醫(yī)藥等領域。

        自1960年以來,人們就嘗試采用各種方法制備乳鐵蛋白,例如采用色譜法、超濾法、鹽析法以及酸沉淀法等從人或牛乳中分離純化LF[5]。Groves利用DEAE纖維素陰離子交換樹脂分離出較純的乳鐵蛋白,此后他又開發(fā)出磷酸纖維素交換色譜法,并由Foley加以改進,得到乳鐵蛋白的純度為81%左右。羧甲基陽離子交換色譜法被應用于乳鐵蛋白和乳過氧化氫酶的分離,用pH值為7.7,濃度為0.05 mol/L磷酸鈉或濃度為0.3 mol/L的NaCl洗脫液洗脫,它可把乳鐵蛋白分為a,b 2種變異體。樹脂能用濃度為0.2 mol/L的NaOH和濃度為0.2 mol/L的HCl再生,此法較DEAE纖維法更有效[6-8]。

        本研究采用強陽離子交換色譜梯度洗脫法,成功地從牛乳中分離出了高純度的乳鐵蛋白,并對此分離過程做了適當?shù)膬?yōu)化,從而為LF的大規(guī)模開發(fā)提供試驗依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        牛乳:四川農(nóng)業(yè)大學牧場;TOYOPEARL SP-650M離子交換劑:Toyosoda,Tokyo,Japan;SDS-PAGE 試劑(電泳級):日本分裝;牛血清白蛋白:上海伯奧生物科技有限公司;凝乳酶:廣州裕力寶生物科技有限公司;其它試劑均為分析純:國產(chǎn)。

        1.2 儀器

        層析柱Φ1.6×20 cm:國產(chǎn);微濾器、微孔濾膜(孔徑為0.45 μm):上海興亞凈化器材廠;玻璃濾過裝置(濾板孔徑 7 μm~16 μm):長春市玻璃儀器廠;751-GW分光光度計:上海分析儀器廠;Mini-Protean3垂直板電泳儀:Bio-RAD公司;BS-100A自動部分收集器、BT-200B數(shù)顯恒流泵:上海滬西分析儀器廠;冷凍離心機:Thermo;79-1磁力加熱攪拌器:金壇市富華儀器有限公司;2X2-2型旋片真空泵:浙江黃巖求精真空泵廠。

        1.3 方法

        1.3.1 牛乳的預處理[9]

        除奶油:從牧場取回鮮牛乳,用4層消毒紗布過濾,除去大部分雜質;然后用離心機分離脫脂(797r/min,20 min,30℃~40℃);脫脂乳經(jīng)抽濾除去大的脂肪球。

        除酪蛋白:脫脂乳水浴加熱至34℃,加入0.1 g凝乳酶于1 L脫脂乳中,攪拌均勻,34℃凝乳1 h,分離出乳清;乳清經(jīng)抽濾除去大的酪蛋白顆粒,濾液離心(3985 r/min,25 min,4℃)去除小的酪蛋白顆粒,得到澄清的乳清。

        超濾:乳清用0.45 μm濾膜過濾,去除小的脂肪球、不溶性蛋白質和乳糖等小分子雜質。

        濃縮:膜過濾后的乳清經(jīng)透析濃縮,便于進一步純化。

        1.3.2 離子交換層析[9]

        TOYOPEARL SP-650M(Toyosoda,Tokyo,Japan)被準備作為強陽離子交換層析填料,填柱1.5 cm×18 cm。先用pH6.6、0.05 mol/L磷酸鈉起始緩沖液平衡離子交換柱和試樣,未被吸附的蛋白質被起始緩沖液洗脫,被吸附的蛋白質用NaCl溶液梯度洗脫,即pH6.6、0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液和 0 mol/L~1 mol/L NaCl溶液連續(xù)梯度洗脫2 h,流速為4.0 mL/min。各個洗脫峰分別收集,在280 nm下測定其吸光度值(OD280),并繪制洗脫曲線。

        1.3.3 LF的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳(SDSPAGE電泳)[10]

        分離膠緩沖液 1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.8);濃縮膠緩沖液 1 mol/L Tris.HCl緩沖液(pH6.8);單體29%(W/V)Acr+1%(W/V)Bis;電極緩沖液 25 mmol/L Tris,0.25 mol/L 甘氨酸,含 0.1%(W/V)SDS,pH8.3;聚合起始劑新鮮配制的10%過硫酸銨溶液;聚合促進劑TEMED;染色液0.25%(W/V)考馬斯亮蘭R-250,45%(V/V)甲醇,10%(V/V)冰醋酸:脫色液 10%(V/V)乙醇,35%(V/V)甲醇。垂直板電泳分離膠和濃縮膠的組成見表1。

        表1 分離膠和濃縮膠的組成Table 1 Constitutes of separating gel and concentrating gel

        電泳條件:恒流10 mA。

        相對遷移率(Rf)的計算:

        Rf=蛋白質樣品距加樣端的距離/溴酚藍帶距加樣端的距離

        1.3.4 蛋白質含量測定

        考馬斯亮藍染色法[10]。牛血清白蛋白的標準曲線見圖1,標準曲線方程為Y=0.0588X+0.0106,相關系數(shù)為0.9943。

        2 結果與討論

        2.1 LF的提取

        從牛乳中提取LF可分為4個步驟:(1)離心分離脫脂得到脫脂牛乳;(2)凝乳酶凝乳除酪蛋白得乳清;(3)乳清經(jīng)膜過濾除去不溶性蛋白質、乳糖等小分子雜質;(4)膜過濾乳清經(jīng)透析濃縮除去大部分的水。

        提取過程中蛋白質含量的變化見表2。

        表2 提取過程中蛋白質含量變化Table 2 Variation of protein content during extraction

        據(jù)文獻報道,乳中蛋白質含量為2.9%~4.5%,平均為3.4%,其中酪蛋白為2.9%,乳清蛋白為0.5%[11]。由表2可知,脫脂過程除去大部分脂肪,蛋白質損失較少;酪蛋白沉淀分離得乳清后,蛋白質總量下降明顯,說明乳中酪蛋白含量較多;乳清經(jīng)膜過濾除去不溶性蛋白質等小分子雜質,蛋白質含量略有降低,離心超濾過程中分子量為90000 u以下的低分子蛋白質可能透過超濾膜,分子量為150000 u以上的蛋白質被截留而除去;乳清經(jīng)透析濃縮,蛋白質含量明顯增加,這是由于用截留分子量12000 u的透析袋除去了鹽和大量的水,蛋白質被濃縮。

        2.2 LF的分離純化

        起始緩沖溶液pH的選擇決定于被分離物質的等電點、穩(wěn)定性和溶解度,也受離子交換劑的影響。本文研究起始緩沖液即磷酸鹽緩沖液pH值分別為6.4、6.6、7.0對乳鐵蛋白純化的影響。

        在上樣前用pH分別為6.4、6.6、7.0的0.05 mol/L磷酸鈉起始緩沖液平衡陽離子交換層析柱,上樣后再用起始緩沖液平衡至基線,最后用0 mol/L~1 mol/L NaCl(起始緩沖溶液中)進行梯度洗脫,結果見圖2~圖4。

        由圖2~圖4可知,梯度洗脫前,未被離子交換劑吸附的大量雜蛋白已流出;根據(jù)采用不同pH的起始緩沖液,梯度洗脫得到的洗脫峰不同,pH6.4和7.0的起始緩沖液分離得到2個洗脫組分,分別為乳過氧化物酶、LF,即LF-α和LF-b沒有完全得到分離;而pH6.6的起始緩沖液分離得到3個洗脫組分,分別為乳過氧化物酶、LF-α及LF-b。

        由此可見,離子交換所需的起始緩沖液pH值一定要選擇合適,緩沖液pH值不能與LF的等電點相差太小也不能相差太大,它會導致將所有蛋白質都不加選擇地洗脫下來,從而影響LF的純度和得率,綜合考慮離子交換后洗脫峰蛋白質的量及乳鐵蛋白的純度,起始緩沖液pH值為6.6最佳。

        不同條件下進行離子交換層析,分別收集其目標洗脫峰,用考馬斯亮藍法測蛋白含量,計算乳鐵蛋白的量,結果見表3。

        表3 上樣緩沖液pH值對目的峰中乳鐵蛋白量的影響Table 3 Affect of pH of buffer on LF content in objective peak

        由表3可知,pH6.6時洗脫出來的目的峰中乳鐵蛋白量最高,pH6.4時次之,pH7.0時最低。

        2.3 LF的SDS-PAGE電泳

        標準蛋白、收集的LF,進行SDS-PAGE電泳檢測,電泳圖譜見圖5;蛋白質相對分子質量與相對遷移率之間的關系如圖6所示。

        從圖5可以看出,分離出的LP為單一區(qū)帶,已達電泳純,經(jīng)計算其相對分子質量為80920 u,試驗結果與文獻中報道的LF相對分子質量為80000 u左右一致,對電泳凝膠進行掃描和數(shù)據(jù)分析,LF的純度為95%。

        3 結論

        牛乳經(jīng)離心脫脂、酶凝乳除酪蛋白后,通過強陽離子交換色譜梯度洗脫分離純化得到LF,洗脫條件確定為:上樣量10 mL,pH 6.6,濃度為0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液進行平衡洗脫,濃度為0 mol/L~1 mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫。

        利用考馬斯亮藍、SDS-PAGE電泳定性定量檢測。結果表明:每毫升牛乳能提取乳鐵蛋白0.23 mg,純度為95%。

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        Isolation and Purification of Lactoferrin in Bovine Milk

        XIAO Lan,ZHANG Zhen-yu,WANG Xi,XIN Song-lin
        (Sichuan Higher Institute of Cuisine,Chengdu 610072,Sichuan,China)

        2010-04-30

        基金來源:四川省教育廳青年基金項目(09ZB057);成都大學肉品重點實驗室一般項目(10R06)

        肖嵐(1981—),女(漢),助教,研究生,從事食品加工方面研究。

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