侯娟，王際輝，葉淑紅，王晗

（大連工業(yè)大學(xué)生物與食品學(xué)院，遼寧大連116034）

利用響應(yīng)面法優(yōu)化蝦青素發(fā)酵培養(yǎng)基

侯娟，王際輝*，葉淑紅，王晗

（大連工業(yè)大學(xué)生物與食品學(xué)院，遼寧大連116034）

以紅法夫酵母為研究對象，對其生物合成蝦青素的培養(yǎng)基組分進(jìn)行研究。首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定最適培養(yǎng)基組分。再利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法考察培養(yǎng)基組分對蝦青素生物合成的影響，選出2個對蝦青素生物合成最為重要的營養(yǎng)因素：葡萄糖和復(fù)合氮源（牛肉膏∶檸檬酸三銨=1∶2，質(zhì)量比）。最后通過響應(yīng)面法確定紅法夫酵母產(chǎn)蝦青素最佳培養(yǎng)基組分，分別為葡萄糖3.65%，復(fù)合氮源0.45%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸粉0.1%，CaCl20.01%。此時蝦青素含量可達(dá)到11.81 mg/L，比優(yōu)化前提高了近190%。

紅法夫酵母；蝦青素；培養(yǎng)基；響應(yīng)面法

Abstract:The paper focused on the fermentation medium components of astaxanthin produced by Phafia rhodozyma.At first,the fermentation components of the strain were studied through single factor tests.Then the effect of the medium compositions on astaxanthin biosynthesis was investigated according to the Plackett-Burman design.The two important factors,glucose and complex nitrogen source（beef extract:ammonium citrate acid=1 ∶2，mass ratio） for astaxanthin biosynthesis were selected from all factors.At last response surface methodology was applied to optimize medium components：glucose3.65%,complex nitrogen source 0.45%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O 0.05%，yeast extract 0.1%，CaCl20.01%.Then the yield of astaxanthin reached 11.81 mg/L，which increased 190%compared with that of the non-optimized condition.

Key words:Phaffia rhodozyma;astaxanthin;fermentation medium;response surface methodology

蝦青素是一種具有優(yōu)良的色素沉積作用、能促進(jìn)動物發(fā)育、具有超強(qiáng)抗氧化活性及較強(qiáng)抗腫瘤活性的類胡蘿卜素[1-3]。紅法夫酵母是研究最多的微生物，其具有作為蝦青素生物來源的一些必要特征：蝦青素是主要的類胡蘿卜素，大約占到40%~95%，能夠利用多種糖作為碳源進(jìn)行異養(yǎng)代謝；培養(yǎng)時間短；不需要光照；能夠在發(fā)酵罐中實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)[4]。因而紅法夫酵母被認(rèn)為是一種最具研究價值的蝦青素大規(guī)模生產(chǎn)的來源。雖然利用紅法夫酵母生產(chǎn)蝦青素獲得了一系列的成果，但是與其他新興發(fā)酵產(chǎn)品相比，酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素具有產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高等問題，大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)不普遍。因此，還應(yīng)在培養(yǎng)基的優(yōu)化，降低生產(chǎn)成本和提高產(chǎn)量等方面作深入研究。

通過培養(yǎng)基優(yōu)化，來提高蝦青素的含量和原料的利用率，以得到適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株都具有重要的理論意義和應(yīng)用價值[5]。以此為出發(fā)點(diǎn)，利用響應(yīng)面法[6]，優(yōu)化紅法夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的培養(yǎng)基。

1 材料和方法

1.1 菌種

紅法夫酵母：大連工業(yè)大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 主要培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.3%，麥芽汁0.3%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸粉 0.1%，CaCl20.01%。

1.3 培養(yǎng)條件

種子搖瓶：250 mL的三角瓶裝液25 mL，從斜面上取兩環(huán)菌種在22°C，150 r/min,培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：250mL三角瓶裝液30mL，接種量10%，22 °C，150 r/min，培養(yǎng) 72 h。

1.4 測定方法

1.4.1 蝦青素的提取

二甲亞砜(DMSO)法[6]：取10 mL發(fā)酵液,離心后用去離子水洗滌離心3次，加3.5 mL 55℃的DMSO破壁，最后用15 mL丙酮提取。離心(8000 r/min，5 min)取上清液。如果提取不完全，再次破壁后加丙酮提取，直至菌體呈白色為止。并測出對應(yīng)的菌體生物量。

1.4.2 蝦青素含量的測定

分光光度法[7]：在480 nm下測丙酮提取液OD值。

式中：蝦青素總量，mg/L；A為吸光度；Va為提取液的體積，mL；E為丙酮的消光系數(shù)（0.16）；Vb為發(fā)酵液的體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源種類對紅法夫酵母生長和蝦青素合成的影響

在無碳源發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別添加20 g/L葡萄糖、蔗糖、乳糖、乙醇和可溶性淀粉，于22℃，150 r/min下發(fā)酵72 h，然后測定生物量和蝦青素產(chǎn)量，結(jié)果見圖1。

微生物利用碳源物質(zhì)具有選擇性。從圖1可知，葡萄糖和蔗糖利于生物量和蝦青素的積累，蔗糖的生物量高于葡萄糖，但蝦青素的積累卻低于葡萄糖。以乙醇和淀粉為碳源時，蝦青素的胞內(nèi)比例較高，但是由于生物量較低，造成蝦青素的產(chǎn)量較低。而以乳糖為碳源時，生物量和蝦青素產(chǎn)量均較低，菌體幾乎沒有生長?？赡苁怯捎诩t法夫酵母體內(nèi)缺乏乳糖分解利用的酶。從蝦青素產(chǎn)量角度，選用葡萄糖作為發(fā)酵的碳源。

2.2 氮源種類對紅法夫酵母生長和蝦青素合成的影響

在無氮源發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別添加5 g/L蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、硫酸銨和檸檬酸三銨，于22℃，150 r/min下發(fā)酵72 h，然后測定生物量和蝦青素產(chǎn)量，結(jié)果如圖2。

從圖2可以看出，牛肉膏對生物量和蝦青素的積累最好，其次為酵母膏和蛋白胨，均為有機(jī)氮源。無機(jī)氮源中，檸檬酸三銨最利于蝦青素的積累。雖然最利于菌體生長和蝦青素積累的氮源是牛肉膏，但是牛肉膏的價格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他氮源，尤其是無機(jī)氮源。綜合考慮蝦青素的產(chǎn)量和生產(chǎn)成本，以牛肉膏和檸檬酸三銨為混合物作為發(fā)酵氮源，并通過試驗(yàn)進(jìn)一步確定二者的最適配比為1∶2（質(zhì)量比）。

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，以及其它文獻(xiàn)報道，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖、復(fù)合氮源、酵母抽提物、MgSO4·7H2O、KH2PO4和 CaCl2濃度 6 個因素作為考察對象，應(yīng)用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對各個因素的重要性進(jìn)行研究。表頭設(shè)計(jì)及試驗(yàn)列表見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Design and results of Plackett-Burman

利用MINITAB軟件進(jìn)行各因素主效應(yīng)分析結(jié)果見表2。

表2 各因素水平及顯著性分析效應(yīng)值Table 2 Prominent analysis of factor levels and effect value

經(jīng)分析檢驗(yàn)得出可信度>90%的兩個因素為葡萄糖和復(fù)合氮源，其他幾個因素的可信度均<90%。因此，把酵母浸粉、硫酸二氫鉀、硫酸鎂和氯化鈣固定在原來的水平，選擇葡萄糖和復(fù)合氮源進(jìn)一步做響應(yīng)面試驗(yàn)。對蝦青素產(chǎn)量進(jìn)行回歸分析所得的系數(shù)的一次擬合回歸方程為：

該方程的方差分析(ANOVA)表明,F=5.41。證明該模型在α=0.05水平顯著，失擬項(xiàng)P值為0.042，表明失擬不顯著。方程的相關(guān)系數(shù)R2為86.66%，調(diào)整后R2為70.65%，表明模型可以解釋70.65%的蝦青素提高水平的變化，說明方程的擬合度較好。

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

由表2的分析結(jié)果，對葡萄糖和復(fù)合氮源進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，顯著因素的變化步長及方向的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of the most climb slope experiment

由表3可知，最佳條件處于第3組，所以選取這一組為中心點(diǎn)，即葡萄糖36 g/L，復(fù)合氮源4.5 g/L。

2.5 響應(yīng)面分析的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)選擇對蝦青素有顯著影響的因子，然后采用中心組合設(shè)計(jì)對這些因素進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。中心組合試驗(yàn)因素水平如表4，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5。利用MINITAB軟件的多項(xiàng)式回歸分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得到二次多項(xiàng)式，它是一個描述響應(yīng)值（因變量）與影響因子（自變量）關(guān)系的模型。根據(jù)回歸系數(shù)的顯著性判斷顯著影響因素，以及各因素之間是否存在交互作用。最后進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，分析試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，得到優(yōu)化結(jié)果。

表4 中心組合試驗(yàn)因素水平表Table 4 Factor levels of central composed experiment

表5 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表Table 5 Design and results of central composed experiment

運(yùn)用MINITAB軟件對表5的試驗(yàn)設(shè)計(jì)做回歸分析得到回歸方程為:

該方程表達(dá)了蝦青素產(chǎn)量與所選的兩個因素之間的關(guān)系?；貧w方程的方差分析如表6，可以看出該回歸模型在α=0.05水平顯著，失擬項(xiàng)0.070，表明失擬不顯著，該二次方程模型能很好的解釋試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性。方程的相關(guān)系數(shù)R2為94.17%，調(diào)整后的R2為90.01%，表明模型可以解釋90.01%的蝦青素含量水平的變化，說明該回歸方程為培養(yǎng)基成分的優(yōu)化提供了一個合適的模型。同時該方程的各因子與響應(yīng)值之間高度顯著。回歸方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)都高度顯著，而回歸方程的交互項(xiàng)不顯著，因此各因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。

表6 回歸方程的方差分析Table 6 Variance analysis of regression equation

圖3為響應(yīng)面等高線圖與立體圖。

從圖3中可直觀地看出各因子對象應(yīng)知的影響變化趨勢，且回歸模型確實(shí)存在最大值。利用MINITAB軟件的響應(yīng)優(yōu)化器對響應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，得到預(yù)測的響應(yīng)為 11.89 mg/L，全局解為：X1=36.5，X2=4.5，即:葡萄糖加入量36.5 g/L，復(fù)合氮源為4.5 g/L時，可得到蝦青素產(chǎn)量為11.89 mg/L。為了驗(yàn)證模型的正確性，利用上述條件做了驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)過3次試驗(yàn)取平均值得到對于1 L的發(fā)酵培養(yǎng)基，葡萄糖添加量為36.5 g、復(fù)合氮源為4.5 g、磷酸二氫鉀為1 g、酵母浸粉1 g、硫酸鎂0.5 g和氯化鈣0.1 g時，得到蝦青素的量為11.81 mg/L，這與理論預(yù)測值相差不大，比優(yōu)化前提高了近190%。因此，利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的培養(yǎng)基成分參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價值。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化發(fā)酵，在蝦青素的生產(chǎn)過程中，碳源和氮源起主要作用。優(yōu)化后的培養(yǎng)基為葡萄糖3.65%，復(fù)合氮源（牛肉膏：檸檬酸三銨=1∶2）0.45%，磷酸二氫鉀0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸粉 0.1%，CaCl20.01%。在此培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行500 mL搖瓶發(fā)酵，蝦青素的產(chǎn)量為11.81 mg/L，比優(yōu)化前提高了190%。本試驗(yàn)得到了產(chǎn)蝦青素紅法夫酵母液體培養(yǎng)基的一個非常合適的模型，同時說明響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件卓有成效，為蝦青素的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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Application of Response Surface Method in Fermentation Medium Optimization for Astaxanthin Production

HOU Juan,WANG Ji-hui*,YE Shu-hong,WANG Han
（School of Biology and Food Engineering,Dalian Polytechinic University,Dalian 116034，Liaoning,China）

2009-09-08

遼寧省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃（2007T009）；遼寧農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化計(jì)劃（2007211001；2008301029）；大連市科技計(jì)劃（2008B12NC059）

侯娟（1984—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通訊作者：王際輝，教授。