高連勝 李 陽

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

DMEM培養(yǎng)基根據(jù)研究結(jié)果篩選后，選用了部分進(jìn)口產(chǎn)品和國產(chǎn)產(chǎn)品相結(jié)合的方法進(jìn)行，而小牛血清則全部選用國產(chǎn)產(chǎn)品。利用自制蒸餾水，在配制DMEM基礎(chǔ)液前再使用0.1um濾器進(jìn)行過濾。

1.2 實(shí)驗條件及方法

實(shí)驗組將一支P26代CHO－C28細(xì)胞種子傳出來的90個單層轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞按每組15瓶分成六個實(shí)驗組，即A組、B組、C組、D組、E組、F組（分組見表1）。

將每個單層瓶的細(xì)胞傳入1個三層轉(zhuǎn)瓶中，細(xì)胞生長液PH控制在6.8～7.4之間，細(xì)胞培養(yǎng)溫度為37℃恒溫，轉(zhuǎn)機(jī)轉(zhuǎn)速為8轉(zhuǎn)/h，培養(yǎng)48 h后，更換1次細(xì)胞生長液。

維持上述細(xì)胞培養(yǎng)條件，三層轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，將細(xì)胞生長液更換為細(xì)胞維持液。細(xì)胞維持液PH控制在6.8～7.4之間，細(xì)胞培養(yǎng)溫度為37℃，細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)機(jī)轉(zhuǎn)速提高到15轉(zhuǎn)/ h，細(xì)胞培養(yǎng)時間為48 h，收取細(xì)胞培養(yǎng)液。按此條件共收取20次維持液。每次收取維持液后，抽取樣品作血凝滴度試驗，檢測每組HBsAg表達(dá)量（具體結(jié)果見表3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果

2.1.1 生長液階段細(xì)胞培養(yǎng)

CHO C28細(xì)胞經(jīng)單層培養(yǎng)瓶一傳一，傳入三層培養(yǎng)瓶中，使用生長液細(xì)胞培養(yǎng)8 h后，鏡下觀察細(xì)胞貼壁生長情況。其中，A組、C組、D組和F組細(xì)胞貼壁率可達(dá)85%，B組和E組細(xì)胞貼壁率約為80%。各組細(xì)胞形態(tài)以圓形、橢圓形為主，細(xì)胞排列松散，可見梭形細(xì)胞生長。

生長液細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，鏡下觀察細(xì)胞貼壁生長情況。A組、C組、D組和F組細(xì)胞貼壁率可達(dá)95%以上，細(xì)胞排列緊密，梭形細(xì)胞均在80%以上。其中，A組和D組細(xì)胞生長情況更為良好，梭形細(xì)胞約占85%左右。B組和E組細(xì)胞貼壁率為90%左右，細(xì)胞排列較緊密，梭形細(xì)胞占在70%左右。

表1 CHO-C28細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗組的分組情況

各組細(xì)胞通過不同培養(yǎng)液的培養(yǎng)后，A組、C組、D組和F組細(xì)胞生長貼壁情況、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長速度等指標(biāo)較好于B、E組的細(xì)胞（結(jié)果見表2）。

2.1.2 維持液階段細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入維持液階段后，各組細(xì)胞均出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，鏡下觀察細(xì)胞貼壁生長情況。其中，A組、C組、D組和F組細(xì)胞貼壁緊密，細(xì)胞成片脫落現(xiàn)象較輕。B組和E組細(xì)胞排列較緊密，細(xì)胞成片脫落現(xiàn)象嚴(yán)重。對各組作血凝滴度實(shí)驗測定HBsAg表達(dá)量（結(jié)果見表3）。

2.2 分析

由于六個實(shí)驗組的細(xì)胞是來源于一支細(xì)胞種子，且最初分組時各組細(xì)胞生長情況基本相同，同時在配制各組培養(yǎng)液時除成分不同，其他的條件均保證相同。因此，我們可以認(rèn)定是細(xì)胞培養(yǎng)液中血清質(zhì)量造成細(xì)胞生長培養(yǎng)過程中出現(xiàn)上述現(xiàn)象。細(xì)胞維持液階段的生長狀態(tài)與收取20次維持液的血凝滴度表明A、C、D、F組細(xì)胞脫落現(xiàn)象較輕，收取的細(xì)胞培養(yǎng)液中抗原表達(dá)量較高。其中發(fā)現(xiàn)進(jìn)口DMEM與國產(chǎn)DMEM在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，質(zhì)量表現(xiàn)均非常穩(wěn)定。但從生產(chǎn)成本上考慮，選擇國內(nèi)某公司提供的DMEM作為C28細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。全部由國內(nèi)廠家提供的小牛血清在細(xì)胞生長液和維持液階段表現(xiàn)都很穩(wěn)定，兩種血清質(zhì)量差異不明顯，能保證我們CHO-C28細(xì)胞的正常生長。

表2 生長液階段CHO-C28細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗結(jié)果

表3 CHO-C28細(xì)胞培養(yǎng)維持液階段血凝滴度實(shí)驗結(jié)果

3 討論

在重組乙肝疫苗生產(chǎn)過程中，影響CHO-C28細(xì)胞HBsAg表達(dá)量的因素有很多，包括溫度、PH值、DMEM、小牛血清、蒸餾水的質(zhì)量，細(xì)胞培養(yǎng)液配制時添加補(bǔ)充液體的比例、細(xì)胞傳代時胰酶活性及胰酶消化時間、操作人員技術(shù)熟練程度等。本文僅就DMEM、和小牛血清兩種主要原料在乙肝疫苗生產(chǎn)過程中對細(xì)胞培養(yǎng)的重要影響進(jìn)行了初步實(shí)驗和分析，其他條件還有待今后進(jìn)一步逐一實(shí)驗和探討。

在乙肝疫苗生產(chǎn)過程中，應(yīng)對原輔料的進(jìn)貨渠道嚴(yán)格把關(guān)。做到嚴(yán)格執(zhí)行SOP，保證每種原輔料的質(zhì)量合格，減少批間差，確保生產(chǎn)的乙肝疫苗批批合格。

[1]金立杰，孫俊業(yè).重組CHO乙肝疫苗細(xì)胞培養(yǎng)收換液改進(jìn)[J].工藝,2002(4):37-39.

[2]李玉,姚偉,張巖銳,等.重組CHO細(xì)胞培養(yǎng)過程中代謝產(chǎn)物對細(xì)胞分泌HBsAg的影響[J].醫(yī)藥生物技術(shù),2002,9(4).

[3]孫祥明,張元興.重組CHO細(xì)胞培養(yǎng)過程中氨對細(xì)胞代謝的影響[J].2001(3).