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        鴨疫里默氏桿菌的分離、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化

        2010-09-12 01:16:44馬志偉劉世超許家榮許俊才
        浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2010年5期
        關(guān)鍵詞:鴨疫氏桿菌瓊脂

        馬志偉,劉世超,許家榮,許俊才

        (南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210000)

        鴨疫里默氏桿菌病,又稱為鴨疫綜合征、鴨敗血癥、鴨傳染性漿膜炎和鴨疫巴氏桿菌感染,是由鴨疫里默氏桿菌 (Riemerella anatipestifer,RA)引起的鴨、鵝、火雞等多種禽類的一種急性或慢性敗血性傳染?。?],是目前對世界各國養(yǎng)鴨業(yè)造成危害最為嚴重的傳染病之一,給養(yǎng)鴨業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。該病最早由Riemer于1904年報道發(fā)生在鵝群中;1932年,美國學(xué)者 Hendrikson和 Hibert報道在紐約長島的鴨場中發(fā)現(xiàn);在我國,1975年鄺榮祿等首次報道該病在廣州存在。1982年郭玉璞等從北京郊區(qū)鴨場首次分離到RA以來,河南、福建、四川等地均相繼報道了RA感染,近年來該病依然普遍流行[2]。

        RA主要感染1~8周齡鴨,尤其是2~3周齡雛鴨,此外也感染鵝和雞等禽類,其流行無明顯的季節(jié)性。一年四季均可發(fā)生,冬季和春季發(fā)病相對較多,夏季相對較少。本病的發(fā)生和飼養(yǎng)管理條件等因素有關(guān),主要通過污染的飼料、飲水、飛沫、塵土等經(jīng)呼吸道和損傷的皮膚,尤其是腳蹼受傷等途徑以水平方式傳播,低溫陰雨、潮濕、寒冷的環(huán)境易誘發(fā)本病的發(fā)生,如飼養(yǎng)密度過大、通風(fēng)不良、衛(wèi)生條件差、轉(zhuǎn)舍時受寒冷或雨淋的刺激等均可引起該病暴發(fā)流行,加劇該病的發(fā)生和病鴨死亡[3]。該病的發(fā)病率可達90%以上,死亡率一般在5%~75%之間。迄今為止,國際上共報道RA有 21 個血清型 (1 ~21 型)[4-7]。

        2009年4月江蘇省南京市郊區(qū)某種鴨場15日齡的櫻桃谷小鴨爆發(fā)疑似鴨疫里默氏桿菌病的疫情,全場90%小鴨發(fā)病,死亡率達45%,損失嚴重。我們對該病進行了較為系統(tǒng)的研究。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 病料來源

        從發(fā)病鴨中選擇具有典型臨床癥狀、剖檢具有典型心包炎、肝周炎等鴨疫里默氏桿菌病典型癥狀的病鴨。

        1.1.2 培養(yǎng)基

        普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱平板、血瓊脂平板、胰酶大豆瓊脂平板 (TSA)、胰酶大豆培養(yǎng)基(TSB)。

        1.1.3 試劑

        革蘭氏染液、瑞氏染液;微量生化發(fā)酵管;初生牛血清;鴨疫里默氏桿菌1、2型陽性血清 (浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院韋強研究員惠贈)。

        1.1.4 試驗動物

        從養(yǎng)鴨場選購未免疫健康雛鴨,品種:櫻桃谷鴨。

        1.2 方法

        1.2.1 細菌分離培養(yǎng)

        無菌采取患病雛鴨的心血、肝臟、氣囊、腦等組織及滲出物,分別劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板、TSA平板、麥康凱平板、血瓊脂平板上,置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。再將典型疑似菌落進一步劃線接種于TSA平板上,進一步做純化培養(yǎng)。

        1.2.2 菌落形態(tài)觀察

        將分離到的細菌挑取單個菌落劃線接種于血瓊脂平板和TSA平板上,觀察菌落形態(tài)。

        1.2.3 染色鏡檢

        按常規(guī)方法對典型疑似菌落進行革蘭氏染色和瑞士染色,鏡檢。

        1.2.4 生理生化試驗

        無菌鉤取分離細菌純培養(yǎng)物少許,接種于微量生化發(fā)酵管中,分別做麥芽糖、果糖、棉子糖、木糖、側(cè)金盞花醇、山梨醇、甘露醇發(fā)酵利用試驗、吲哚試驗、枸櫞酸鹽利用試驗、產(chǎn)硫化氫試驗、脲酶試驗、硝酸鹽還原試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、氨基酸脫羧酶試驗、MR試驗、VP試驗、明膠液化試驗。

        1.2.5 血清學(xué)鑒定

        挑取平板上的單個菌落接種于TSA培養(yǎng)平板,置37℃培養(yǎng)36 h,按常規(guī)方法做玻片凝集試驗。用兔抗鴨疫里默氏桿菌1、2型陽性血清進行鑒定,有凝集現(xiàn)象的為陽性,以無菌生理鹽水作對照。

        1.2.6 PCR鑒定

        引物設(shè)計與合成。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的所有16S rRNA的基因序列,找到RA 16S rRNA的高度保守區(qū),設(shè)計一對特異性引物:上游引物為5′-GAGACACGGACCAGACTCCTACG-3′,下 游 引 物為 5′-ACCTCACGGCACGAGCTGACGACA-3′; 由 上海英駿生物公司合成,擴增長度為749 bp。

        PCR反應(yīng)體系及程序。以細菌的純培養(yǎng)物為模板,利用設(shè)計好的引物進行PCR擴增。

        PCR反應(yīng)體系 (25 μL):菌液 1 μL,上下游引物 (10 μmol)各 1 μL,2 × Mix 12.5 μL,H2O 9.5 μL。

        PCR程序:94℃ 4 min;進入循環(huán)94℃ 45 s,50℃ 45 s,72℃ 1 min,循環(huán)30次;72℃ 7 min;4℃保存。

        PCR產(chǎn)物鑒定。電泳鑒定:將 PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳 (含GoldView),并用凝膠成像系統(tǒng)觀察是否出現(xiàn)目的條帶,并拍照記錄。

        測序鑒定:將PCR產(chǎn)物回收純化后送上海英駿生物公司測序鑒定。

        1.2.7 培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間優(yōu)化

        將鑒定為陽性的細菌劃線接種于血瓊脂平板,37℃培養(yǎng)36 h,挑取單菌落接種于TSB培養(yǎng)基中,振蕩 (100 r·min-1,下同)培養(yǎng)24 h,分別吸取5 mL菌液接種于4個裝有250 mL TSB培養(yǎng)基的1 L三角瓶中,在A、B、C、D 4種條件下培養(yǎng):A為培養(yǎng)基中加2%初生牛血清,37℃振蕩培養(yǎng),B為培養(yǎng)基中加2%初生牛血清,37℃靜置培養(yǎng),C為37℃振蕩培養(yǎng),D為37℃靜置培養(yǎng)。

        培養(yǎng)每隔一段時間后,無菌條件下分別取少許菌液測D600值。記錄數(shù)據(jù)結(jié)果,并以時間為橫坐標,D600為縱坐標,制作D600-T曲線。

        1.2.8 動物回歸試驗

        將鑒定為陽性并經(jīng)分離純化的細菌,接種于TSB培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)24 h。用生理鹽水洗滌菌體,并稀釋至D600約為0.5。

        將購自養(yǎng)殖場的10日齡健康雛鴨飼養(yǎng)2日使其適應(yīng)環(huán)境,然后隨機分組:對照組2只和試驗組4只,分別稱重。試驗組頸部皮下注射接種0.5 mL菌液,對照組以同樣方法注射0.5 mL無菌生理鹽水。試驗組與對照組分開飼養(yǎng),連續(xù)飼養(yǎng)、觀察1周,記錄鴨子的食用飼料重量、臨床表現(xiàn)等情況;對病死鴨進行病理剖檢觀察,記錄數(shù)據(jù)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 細菌分離培養(yǎng)

        共分離到2株細菌:A和B,在麥康凱平板和普通營養(yǎng)瓊脂平板上不生長,在血瓊脂平板和TSA平板上可見露珠樣小菌落。

        2.2 菌落形態(tài)觀察

        血瓊脂平板和TSA平板上菌落大小及形態(tài)無明顯差異,2株細菌的菌落均呈露珠狀,圓形隆起,表面光滑,邊緣整齊,直徑為1~2 mm,顏色為灰白色,較透明;與RA菌落的形狀相似,疑似為RA。

        2.3 染色鏡檢

        革蘭氏染色后,鏡檢可見革蘭氏陰 (-)性小桿菌,少數(shù)呈橢圓形;瑞士染色后,鏡檢可見小桿狀細菌菌體呈兩極濃染,多為單個分散排列,少數(shù)成雙或短鏈排列。

        2.4 生理生化試驗

        生理生化試驗結(jié)果見表1。

        表1 生理生化試驗結(jié)果

        生理生化試驗結(jié)果與RA相符合,因此,初步認定2株細菌均為鴨疫里默氏桿菌,但仍有待進一步確認。

        2.5 血清學(xué)鑒定

        玻片凝集試驗結(jié)果見表2。

        表2 玻片凝集試驗結(jié)果

        由凝集試驗結(jié)果可以確定,A、B 2株細菌均為鴨疫里默氏桿菌,且血清型相同,均為1型。

        2.6 PCR鑒定

        2.6.1 電泳鑒定

        PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

        圖1 PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果

        由圖1可見,1、2型鴨疫里默氏桿菌均能擴增出目標片段,大小與預(yù)期一致。

        2.6.2 測序鑒定

        2株細菌的序列完全相同,且與所選基因片段序列一致性為100%。因此,可確認這2株細菌為鴨疫里默氏桿菌。

        2.6.3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹

        通過 NCBI網(wǎng)站的 BLAST程序搜索與該16S rRNA基因序列相似度較高的其它菌株的序列,通過ClustalX和Mega程序,將PCR產(chǎn)物序列與其它7株細菌 (RA strain RAf103、Riemerellasp.IPDH 359/90、Uncultured bacterium clone nbw546c05c1、Flavobacteriumsp. 130704W2、 UnculturedCryomorphaceaebacterium clone XZXXH203、Anaerophaga thermohalophilastrain Fru22、Pasteuria goettingianae)的相似序列進行比對,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,如圖2。

        圖2 1型RA與其它7株細菌構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹

        由圖2可以推斷,試驗室所分離到的細菌與RA strain RAf103相同,與 Riemerella sp.IPDH 359/90同屬,與Flavobacterium sp.130704W2同為黃桿菌科,因此可以判定該株細菌為RA。綜上所述,該株細菌為1型鴨疫里默氏桿菌。

        2.7 培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間優(yōu)化

        RA為兼性厭氧菌,其對培養(yǎng)條件的要求較為苛刻,生長速度較慢,不易被分離到,因此需選擇合適的培養(yǎng)條件和時間[9]。為了更加了解RA的生長特性,獲得較佳的培養(yǎng)條件和時間,本試驗對RA的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間進行了研究和分析,結(jié)果見圖3。

        圖3 RA菌在4種培養(yǎng)條件下的生長情況

        由圖3中數(shù)據(jù)可見,A(37℃振蕩,加2%初生牛血清)、B(37℃靜置,加2%初生牛血清)、C(37℃振蕩)、D(37℃靜置)4種培養(yǎng)條件下,RA的生長情況為A條件下速度最快,C條件下其次,B和D條件下的速度較慢;且振蕩培養(yǎng)比向培養(yǎng)基中加入2%初生牛血清對RA生長的促進作用更加明顯,因此,在培養(yǎng)RA時,應(yīng)盡可能振蕩培養(yǎng)。

        從圖3可以看出,在A和C(均37℃振蕩培養(yǎng))2種培養(yǎng)條件下,RA的生長在28~32 h從對數(shù)期進入穩(wěn)定期;而在B和D(均37℃靜置培養(yǎng))培養(yǎng)條件下,RA的生長沒有出現(xiàn)明顯地從對數(shù)期向穩(wěn)定期的轉(zhuǎn)變。因此,RA在振蕩條件下培養(yǎng)28 h,即可完成培養(yǎng),節(jié)省培養(yǎng)時間,若培養(yǎng)時間過長,RA進入穩(wěn)定期,則會影響RA的生長。

        2.8 動物回歸試驗

        動物回歸試驗結(jié)果見表3。

        在飼養(yǎng)過程中,對照組鴨長勢良好,育肥迅速,平均每日增重50 g,肉料較高,相對節(jié)約了飼料消耗,增加了養(yǎng)鴨場的經(jīng)濟效益,2只鴨均無患病臨床癥狀;剖解后未見任何病變,心臟、肝臟等器官均正常,且未分離到RA。

        注:CK為注射生理鹽水;RA為注射1型RA;Δ體重為1周內(nèi)雛鴨體重變化;Δ飼料為1組雛鴨1周內(nèi)消耗飼料重量;肉料比為1周內(nèi)雛鴨體重變化與所消耗飼料的比值;死亡數(shù)為1周內(nèi)死亡鴨的數(shù)量。

        試驗組鴨生長速度則大大降低,平均每日增重不到20 g,且肉料較低,使飼養(yǎng)的經(jīng)濟效益降低;試驗組鴨均出現(xiàn)嚴重程度不同的鴨疫里默氏桿菌病的典型臨床癥狀:精神沉郁、萎頓,頭顫動,羽毛粗亂無光澤,食欲下降,肢體無力,行動困難,伏臥不起,排綠色稀糞等。剖解病死鴨發(fā)現(xiàn)各內(nèi)臟器官出現(xiàn)不同程度的病變,心臟明顯較小,心包膜增厚,腸系膜增多,將內(nèi)臟器官包住,肝臟較小,并見心包膜、腸系膜、肝臟外膜周圍出現(xiàn)灰白色纖維素性滲出物。從病死鴨心血、肝均分離到RA,經(jīng)玻片凝集和染色試驗,證明其血清型與攻毒菌相同。

        3 小結(jié)

        鴨疫里默氏桿菌可以使鴨、鵝、火雞等多種禽類患病,導(dǎo)致家禽育肥減慢或死亡,嚴重影響了養(yǎng)鴨業(yè)等的經(jīng)濟效益,給農(nóng)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

        本次研究從養(yǎng)鴨場分離到2株細菌,通過傳統(tǒng)生理生化和分子生物學(xué)2種方法對其進行了鑒定,構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹,充分證明了這2株細菌為1型鴨疫里默氏桿菌。相對傳統(tǒng)方法,分子生物學(xué)方法具有快速、高效、準確的優(yōu)點,本文建立的針對RA的16S rRNA基因PCR技術(shù)可用于快速檢測、鑒定鴨疫里默氏桿菌。

        鴨疫里默氏桿菌對培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求較高,在普通營養(yǎng)瓊脂平板上不生長,為了更好地了解RA的生長特性,本次試驗對RA的生長條件和生長時間進行了研究。試驗結(jié)果表明,RA在37℃振蕩培養(yǎng)能夠較好地生長,提高培養(yǎng)基的營養(yǎng)則能夠進一步促進RA的生長,但效果沒有振蕩培養(yǎng)的明顯,因此在分離和培養(yǎng) RA時,應(yīng)盡可能振蕩培養(yǎng)。

        我們還進行了動物回歸試驗。RA的感染使雛鴨生長速度減慢1/2以上,發(fā)育不良,并使1只試驗組鴨病死,嚴重影響了養(yǎng)鴨業(yè)的經(jīng)濟效益。與這2株RA的來源養(yǎng)鴨場相比,試驗室動物回歸試驗的雛鴨病死率相對較低,分析原因可能是飼養(yǎng)環(huán)境的問題:在大多數(shù)情況下,動物患病并不是由僅僅一種病原的侵染,可能是由于多種病原同時侵染或者病原侵染時動物的飼養(yǎng)環(huán)境較差,如低溫陰雨、潮濕、寒冷等惡劣環(huán)境的刺激,使得動物發(fā)病嚴重,造成病死率很高;而試驗室的飼養(yǎng)條件相對較好,從而導(dǎo)致動物回歸試驗的病死率并不高。所以,加強飼養(yǎng)管理,減少不良環(huán)境因素造成的應(yīng)激反應(yīng),乃是動物生產(chǎn)的基本策略。

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