鐘相根，李宇航，張 前，賈 旭，孫 燕，鄭豐杰，謝 華，劉曉輝，王 蔚，祝小惠，周曉衛(wèi)，田 彥

（北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronicobstructive pulmonary disease，COPD）以氣道不完全可逆性氣流受限為特征，氣流受限呈進行性發(fā)展，與肺對有害氣體或有毒顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)，可伴有氣道高反應(yīng)性［1］。氣道黏液高分泌是氣道阻塞的主要因素之一，是目前COPD發(fā)病機制研究的熱點，認(rèn)為氣道黏液高分泌已成為影響COPD病情和預(yù)后的獨立危險因素［2］，氣管、支氣管樹杯狀細(xì)胞化生是黏蛋白的主要來源，也是黏液過度分泌的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。杯狀細(xì)胞主要分泌黏蛋白5AC（MUC5AC）。目前認(rèn)為，杯狀細(xì)胞化生及其MUC5AC基因表達(dá)的關(guān)鍵介導(dǎo)環(huán)節(jié)涉及白介素-13（IL-13）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號傳導(dǎo)通路。

本課題組在“肺與大腸相表里”臟腑相關(guān)理論指導(dǎo)下，采用氣管內(nèi)注脂多糖和熏煙的復(fù)合法建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型，在觀察了“通利大腸”可改善COPD大鼠肺功能、組織病理損傷、氧化應(yīng)激損傷及可抑制氣道黏液高分泌的基礎(chǔ)上［3、4］，進一步觀察“從腸論治”對COPD大鼠氣道黏液分泌信號調(diào)控的影響，探討COPD“從腸論治”的效應(yīng)機制。

1 材料與方法

1.1 藥物

采用清·吳鞠通《溫病條辨·卷二》宣白承氣湯（生石膏五錢、生大黃三錢、杏仁粉二錢、栝樓皮一錢五分），主要功效宣肺化痰，通腑泄熱。按文獻(xiàn)進行藥量折算后根據(jù)藥物功效與歸經(jīng)將宣白承氣湯拆分為3組：治肺組（生石膏15g，苦杏仁6g，栝樓皮4.5g）、治腸組（生大黃 9g）、肺腸同治組（生石膏15g，苦杏仁 6g，栝樓皮 4.5g，大黃 9g）。

中藥全部購自北京同仁堂藥店，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論與關(guān)鍵技術(shù)研究中心鑒定均為正品。生藥劑量比例按原著換算，依照人單位體重生藥量求得大鼠單位體重生藥量，并擴大10倍。各組藥物分別以蒸餾水煎煮30min，提取2次，再合并煎液，并將所得藥液用雙層紗布過濾，水浴加熱蒸發(fā)濃縮，貯于冰箱中備用。

1.2 動物與分組

清潔級健康 Wistar雄性大鼠，40只，鼠齡10～12周，體重230g±20g，購于北京維通利華實驗動物公司，合格證號SCXK（京）2009-0011。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，采用隨機數(shù)字表法分組，分為正常組、模型組、治腸組、治肺組、肺腸同治組，每組8只。

各給藥組動物，第15～28天每天1次灌胃給予相應(yīng)藥液，正常組及模型組給予等量0.9％生理鹽水，連續(xù)14d。各組于末次給藥后，禁食12h檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.3 COPD大鼠模型的制作

［5］采用氣管注脂多糖加熏香煙方法：在第1天和第14天，用1％的戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于大鼠固定板，暴露聲門，將18號靜脈套管針快速插入氣管，拔出針芯，用1ml注射器注入溶于生理鹽水的 LPS 200μl（1mg/ml），然后將大鼠固定板直立旋轉(zhuǎn)，使 LPS能夠均勻分布于兩肺。正常組注入生理鹽水。第2～第28天（第14天除外），將大鼠置入60cm×50cm×40cm熏吸箱內(nèi)，注入大前門牌過濾嘴香煙煙霧，濃度約5％，每天上午、下午各1 h。檢測用力肺活量（FVC）、第 0.3秒用力呼氣容積（FEV 0.3）、第0.3秒用力呼氣容積與用力肺活量的比（FEV0.3/FVC）、用力中期呼氣流速（FEF25-75）、最大呼氣中期流速（MMF）、用力最大呼氣流速（PEF）等肺功能相關(guān)指標(biāo)。

1.4 儀器與試劑

Light Cycler 2.0實時熒光定量PCR儀（Roche診斷公司）；動物熏吸箱（60 cm×50 cm×40 cm），自制；18號靜脈套管針（馬來西亞制造）。脂多糖，LPS，Sigma公司。大前門牌香煙，上海煙草公司，烤煙型，焦油量12mg，煙氣煙堿量0.9mg，煙氣一氧化碳量14mg。Trizol RNA提取試劑，Invitrogen公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，Promega公司；SYBR Green I實時熒光定量PCR試劑盒，Roche公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5 Realtime-PCR法檢測氣道EGF-R及IL-13 mRNA的表達(dá)

總RNA提?。喝》谓M織約100mg，按照Trizol試劑說明，采用異硫氰酸胍一步法抽提組織總RNA，所提總RNA經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳確定其完整性，并經(jīng)紫外分光光度計檢測所提RNA含量（3μg）和純度（1.8～2.0）。

cDNA合成：分別取3μg總 RNA為模板，在加入Oligo（dT）和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶后以25μl體系在42℃下反應(yīng)1h合成 cDNA第1鏈，之后94℃加熱3min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

實時熒光定量PCR擴增：采用SYBR Green I熒光染料技術(shù)，在 20μl反應(yīng)體系中，加入 cDNA 2μl、ddH2O 13μl、SYBR Green 熒光定量 PCR Mix 4μl、引物 1μl：EGF-R：上 游 引 物：5 ＇-CCC AGT CTA TCA CAA TCA GCC-3＇，下游引物：5＇-GCC CTT AAA GAT GCC ATT CG-3＇，擴增產(chǎn)物長度：247bp。IL-13：上游5′-ATC ACA CAA GAC CAG AAG ACT TC-3′，下游5′-AAC TGG GCT ACT TCG ATT TTGG-3′，擴增產(chǎn)物長度：195bp。用 β-actin基因作為內(nèi)參，β-actin上游引物 5′-GAC ATC CGT AAA GAC CTC TAT GCC-3＇，下游 引 物 5′-CTC TGT GTG GAT TGG TGG CTC TAT-3＇，擴增產(chǎn)物長度：170bp。

反應(yīng)條件：94℃ 10min、94℃ 10s、54℃ 10s、72℃10s，45個循環(huán)。然后做溶解曲線以確認(rèn)是否是單一峰。反應(yīng)結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴增產(chǎn)物是否符合原設(shè)計片段長度。PCR反應(yīng)及數(shù)據(jù)采集在LightCycler 2.0系統(tǒng)上進行，記錄其循環(huán)閾值（CT），每個樣品中靶基因的相對 mRNA表達(dá)采用相對定量公式 2－ΔΔCT計算，ΔΔCt=實驗組（Ct靶基因 －Ctβ-actin）－ 對照（Ct靶基因 －Ctβ-actin）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺功能檢測結(jié)果

與正常組相比，模型組大鼠 FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、FEF25-75、MMF、PEF 降低，提示模型組氣道阻力增加，氣流受限。與模型組比較，用大黃通利大腸的治腸組肺功能顯著改善。與治肺組比較，增加了治腸的肺腸同治組肺功能改善作用增強。結(jié)果已另文發(fā)表，見參考文獻(xiàn)［3］。

2.2 各組大鼠氣道EGF-R mRNA及IL-13 mRNA的表達(dá)

表1顯示，模型組大鼠氣道 EGF-R mRNA、IL-13 mRNA表達(dá)增強，與正常組比較差異有顯著意義（P＜0.01），說明COPD大鼠氣道杯狀細(xì)胞化生及黏蛋白高分泌增強。

表1 各組大鼠氣道EGF-R mRNA及IL-13 mRNA表達(dá)±s）

表1 各組大鼠氣道EGF-R mRNA及IL-13 mRNA表達(dá)±s）

注：與正常組比較：*P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01；與治肺組比較：※P＜0.01

組 別n EGF-R mRNA IL-13 mRNA正 常 組8 0.240±0.077 0.167±0.051模 型 組 8 2.129±0.287* 2.080±0.624*治 腸 組 8 0.753±0.134# 1.101±0.207#治 肺 組 8 1.156±0.214 0.821±0.233肺腸同治組 8 0.520±0.077※ 0.382±0.124※

治腸組EGF-R mRNA、IL-13 mRNA表達(dá)降低，與模型組比較有顯著差異（P＜0.01），提示“從腸論治”能抑制COPD大鼠氣道杯狀細(xì)胞化生及黏蛋白分泌的信號傳導(dǎo)通路，減輕氣道黏液分泌及氣道阻塞，緩解氣流受限。

與治肺組比較，加上“從腸論治”的肺腸同治組EGF-R mRNA、IL-13 mRNA表達(dá)降低（P＜0.01）。提示在治肺的基礎(chǔ)上增加通利大腸，抑制氣道黏液高分泌信號傳導(dǎo)作用增強，有利于進一步改善氣道通氣及肺功能。

3 討論

杯狀細(xì)胞化生和黏液過度分泌是COPD氣道慢性炎癥重要的病理改變，過度分泌的黏液潴留于氣道，加重了業(yè)已狹窄氣道的阻塞，加速了肺功能的下降進程，易導(dǎo)致氣道內(nèi)感染的發(fā)生且不易控制，直接導(dǎo)致病情的惡化乃至死亡。近年的臨床病理研究也顯示，COPD病情惡化死亡患者肺組織基本都可見到小氣道黏液的潴留乃至黏液栓的形成，提示小氣道黏液潴留是病情惡化的重要形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。氣道黏液高分泌的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)被認(rèn)為是上皮杯狀細(xì)胞的廣泛化生和黏膜下支氣管腺的肥大，而在小氣道，由于缺乏支氣管腺增生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其黏液高分泌主要由增生、化生的杯狀細(xì)胞所致。杯狀細(xì)胞化生的關(guān)鍵介導(dǎo)環(huán)節(jié)涉及白介素（IL）-13和表皮生長因子（EGF-R）受體［6～8］。

正常氣道上皮接觸環(huán)境刺激物，可產(chǎn)生炎癥/免疫反應(yīng)介質(zhì)，一些介質(zhì)有促分泌功能，激活表面杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白，一些介質(zhì)可上調(diào)黏蛋白基因轉(zhuǎn)錄。上調(diào)黏蛋白基因轉(zhuǎn)錄是持續(xù)黏蛋白生物合成和高分泌所必需的過程。杯狀細(xì)胞主要分泌 MUC5AC。IL-13是體內(nèi)有力的黏液刺激物，IL-13引起大鼠氣道上皮MUC5AC表達(dá)上調(diào)，除了IL-4受體途徑外，同時有EGFR表達(dá)的增強，給予EGFR酪氨酸激酶抑制劑BBX1522可抑制 MUC5AC表達(dá)，表明IL-13引起氣道黏液高分泌也通過EGFR途徑。此外，IL-13也可直接驅(qū)動黏蛋白基因表達(dá)。許多細(xì)胞因子制作的黏液高分泌氣道炎癥模型均通過產(chǎn)生IL-13來實現(xiàn)。研究顯示，TH2細(xì)胞缺乏IL-13不能刺激產(chǎn)生黏液，而EGFR信號傳導(dǎo)通路是眾多刺激因子如吸煙、過敏原、氧化應(yīng)激、細(xì)菌感染、細(xì)胞因子等誘導(dǎo)MUC5AC基因表達(dá)的共同通路。

本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，“通利大腸”可抑制COPD大鼠氣道黏液高分泌，但其影響?zhàn)ひ悍置诘恼{(diào)控機制還有待深入研究。因此，本實驗選用宣白承氣湯，進一步拆方觀察其治肺組、治腸組及肺腸同治組對COPD大鼠氣道黏液分泌信號調(diào)控機制的影響，并著重對比分析增加“從腸論治”因素對此的干預(yù)作用。

實驗結(jié)果顯示，與正常組相比，COPD組大鼠氣道EGF-R mRNA、IL-13 mRNA表達(dá)增強，提示模型組大鼠氣道杯狀細(xì)胞化生及黏蛋白表達(dá)增強。與模型組比較，用大黃“從腸論治”的治腸組 EGF-R mRNA、IL-13 mRNA表達(dá)降低。與治肺組比較，增加了治腸的“肺腸同治”組抑制氣道杯狀細(xì)胞化生及黏蛋白表達(dá)信號傳導(dǎo)作用。因此，通利大腸或在治肺的基礎(chǔ)上增加通利大腸，均能增強抑制 COPD大鼠氣道氣道杯狀細(xì)胞化生及黏液高分泌信號調(diào)控的作用，從而進一步改善氣道通氣及肺功能。

綜上所述，通過“從腸論治”通腑宣肺，抑制COPD氣道上皮杯狀細(xì)胞化生及黏液高分泌信號傳導(dǎo)，進而抑制黏液高分泌，改善氣道阻塞及減少病原菌定植，這可能是“通利大腸”改善COPD大鼠肺功能的效應(yīng)機制之一，有助于進一步探討肺腸之間效應(yīng)互動的聯(lián)絡(luò)機制。

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△通訊作者：李宇航，醫(yī)學(xué)博士，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)辨證論治規(guī)律研究。北京市朝陽區(qū)北三環(huán)東路11號北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，郵編：100029，E-mail：liyuhang@bucm.edu.cn。