王桂平 葉云 鄭文嶺 馬文麗

肺癌是我國男性和女性最主要致死性癌癥之一，包括小細胞肺癌和非小細胞肺癌[1]。肺腺癌（lung adenocarcinoma）屬于非小細胞肺癌，是最常見的肺癌之一，發(fā)病率約占原發(fā)性肺癌的20%-30%，在許多國家腺癌已超過鱗狀細胞癌。目前，人類對肺腺癌的發(fā)生機制仍不清楚，其發(fā)生發(fā)展可能與體內(nèi)多種癌基因或抑癌基因的表達改變有關(guān)，如k-ras、p53、p16Ink4、HER2/Neu和COX-2等。因此，發(fā)現(xiàn)新的肺腺癌致病基因，對于揭示肺腺癌發(fā)病機制及尋找新的藥物治療靶點有著重要意義。

目前，疾病基因發(fā)現(xiàn)的方法包括連鎖分析法、基因序列相似性、基因功能相似性及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)等多種途徑，其中以基于基因功能相似性方法在人類疾病候選基因發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用最廣泛[2-7]。近年來，許多基于功能相似性的生物信息學(xué)方法在人類疾病基因發(fā)現(xiàn)發(fā)揮重要作用，加速人類疾病基因發(fā)現(xiàn)過程，如POCUS、PROSPECTR、 SUSPECTS及Toppgene等，其中Toppgene具有高通量、快速、重復(fù)性好的優(yōu)點，特別是可對基因提供更全面的評價[2,7,8]。為發(fā)現(xiàn)新的肺腺癌致病基因，本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取肺腺癌數(shù)據(jù)集，并進行差異基因分析，將獲取的差異基因作為“檢測基因集”；同時，采用genecard和Fable文獻挖掘已知肺腺癌疾病基因，并將其定義為“訓(xùn)練基因集”；最后，利用Toppgene篩選肺腺癌候選基因，并通過熒光定量PCR對其獲得的基因進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料 Trizol RNA抽提試劑、PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRPremix Ex TaTM熒光定量PCR試劑盒均由中山醫(yī)達安基因公司提供。3900臺式高通量DNA合成儀、 9700 PCR儀、7500全自動熒光定量PCR儀均為ABI產(chǎn)品。肺腺癌細胞株A549和人支氣管上皮細胞16HBE由廣州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心提供，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，杭州四季青）、雙抗（青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL）的RPMI-1640培養(yǎng)基中。

1.2 方法

1.2.1 獲取GEO數(shù)據(jù)集 首先，我們從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫（http:www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下載2個基因表達譜數(shù)據(jù)集，即GSE7670和GSE10072。其中，GSE7670數(shù)據(jù)集來源于臺灣臺北榮民總醫(yī)院（Taipei veterans general hospital），采用GPL96芯片平臺（[HG-U133A] Affymetrix Human Genome U133A Array），包括27個配對的正常肺組織與肺腺癌組織、2個混合組織、2個商業(yè)化的正常肺組織、1個正常肺上皮細胞株與7個商業(yè)化肺癌細胞株，共64個樣本；而另一個數(shù)據(jù)集GSE10072則來源于美國N.I.H遺傳流行病學(xué)部（Genetic Epidemiology Branch），也采用GPL96芯片平臺，疾病組織類型為肺腺癌，包括58個腺癌和49個正常肺組織，共107個樣本。

1.2.2 肺腺癌差異表達基因分析[9]基因差異表達分析采用dchip軟件分析包進行dchip由哈佛大學(xué)生物統(tǒng)計系Cheng LI等聯(lián)合開發(fā)，是綜合性芯片分析軟件。該軟件運行在于windows平臺，主要分析Affymetrix基因表達譜及SNP芯片數(shù)據(jù)，dchip可進行差異基因識別、方差分析、主成分分析、時間序列分析、層次聚類、連鎖分析及SNP的拷貝數(shù)分析等。我們對GSE10072和GSE7670數(shù)據(jù)集中質(zhì)量合格芯片樣本分別采用dchip進行差異基因分析，具體操作方法按dchip操作指南進行（http://www.dchip.org），2-fold change的基因被選擇為差異表達基因。最后，采用交集方法獲得共同差異基因。

1.2.3 文獻挖掘方法挖掘已知肺腺癌疾病基因 Genecards（http://www.genecards.org/）是一個收集并展示人類基因及其產(chǎn)物和相關(guān)疾病等綜合信息的知識平臺。它是由以色列的Weizmann研究所基因組研究中心和生物信息學(xué)中心共同開發(fā)的，含有46 560個基因資料（2.38版），其中24 824個已經(jīng)被HUGO基因命名委員會審核通過。我們以“l(fā)ung adenocarcinoma”或“adenocarcinoma of lung”作為搜索詞，進入Genecards搜索已知肺腺癌疾病基因[10]。同時，也采用Fable文獻挖掘工具搜索已知肺腺癌疾病基因，F(xiàn)able登陸方式：http://www.fable.chop.edu/。

1.2.4 Toppgene篩選新的肺腺癌疾病基因[11]Toppgene（http://toppgene.cchmc.org/）是個有效而方便的基于基因功能相似性的候選基因篩選方法。我們以Genecards搜索到的已知肺腺癌疾病基因作為“training gene set”，而以來自dchip所獲得的差異基因作為“test gene set”，然后按Toppgene操作方法獲得候選基因。

1.2.5 熒光定量RT-PCR（ΔΔCT法） 收集對數(shù)生長期A549或16HBE細胞，按文獻方法[12-14]分別進行RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系總體積50 μL，由5×SYBR Green I PCR buffer（10 μL）、10 pmol/μL引物F或R（1 μL）、10 mM dNTPs（1 μL）、3 U/μL Taq酶（1 μL）、cDNA（5 μL）及ddH2O （31 μL）構(gòu)成， 以β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)條件設(shè)定為：93oC、3 min，然后93oC、30 s，55oC、45 s，72oC、45 s，共40個循環(huán)。引物設(shè)計與合成利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物，使上下游引物跨越1個內(nèi)含子，由中山大學(xué)達安基因公司合成。設(shè)計引物序列：CD36（擴增片段長度104 bp）：5’-CAGATGCAGCCTCATTTCCA-3’（Forward Primer），5’-AACGTCGGATTCAAATACAGCA-3’（Reverse Primer）；PMAIP1（擴增片段長度79 bp）：5’-GCTCCAGCAGAG CTGGAAGT-3’ （Forward Primer），5’-GAAGTTTCTG CCGGAAGTTCAG-3’（Reverse Primer）；FABP4（擴增片段長度106 bp）：5’-GGCATGGCCAAACCTAACAT-3’（Forward Primer），5’-CCTGGCCCAGTATGAAGGAA A-3’（Reverse Primer）；β-actin（擴增片段長度106 bp）（內(nèi)參基因）：5’-GCATGGGTCAGAAGGATTCCT-3’（Forward Primer），5’-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3’（Reverse Primer）。

1.2.6 熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理 熒光定量PCR實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用2-△△Ct進行處理，其前提是目的基因和內(nèi)參基因擴增效率相似[13]。計算各樣本平均CT值和△CT值（Ct=Ctsatb1-Ctβ-actin），計算2-△△Ct（Ct=Ct目的樣本-Ct參照樣本），其數(shù)值用于表示目的值相對于參照值的相對倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌差異表達基因 為了獲得肺腺癌共同差異表達基因，我們采用dchip分析軟件包分別對GSE10072和GSE7670數(shù)據(jù)集中合格芯片樣本進行差異基因分析，最終獲得共同差異表達基因344個，其中上調(diào)基因94個，下調(diào)基因285個（表1）。

2.2 Genecards獲得已知肺腺癌疾病基因 以“l(fā)ung adenocarcinoma”或“adenocarcinoma of lung”作為搜索詞，進入Genecards搜索已知肺腺癌疾病基因，共獲取230條gene card記錄；“l(fā)ung adenocarcinoma”作為搜索詞，通過Fable獲得118個基因與肺腺癌相關(guān)（過濾n＜10的基因）。對兩種方法獲得的疾病基因進行交集分析，瀏覽每一條文獻，過濾不相關(guān)的基因，最終獲得277個已知肺腺癌疾病基因。

2.3 篩選新的肺腺癌疾病基因 采用Toppgene候選基因篩選方法，共獲得36個候選疾病基因，經(jīng)過文獻分析，15個基因已有在肺癌方面的報道（各基因報道文獻均不多），而另21個基因則在腫瘤方面的研究幾無報道（表2中加下劃線基因）。而對21個基因進行KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)有3個基因（CD36、COL1A1、COL3A1）與ECM-receptor interaction（hsa04512）有關(guān)，3個基因（CSF3、CXCL2、LEPR）與cytokine-cytokine receptor interaction（hsa04060）有關(guān)，而3個基因（EDN1、EDNRB、LEPR）與neuroactive ligand-receptor interaction（hsa04080）相關(guān)。

2.4 熒光定量PCR實驗驗證 為了驗證Toppgene所篩選的基因，我們挑選CD36、PMAIP1及FABP4三個基因，采用熒光定量PCR進行驗證，結(jié)果表明，與對照組相比，CD36、PMAIP1及FABP4在A549細胞中均為下調(diào)表達，此與芯片數(shù)據(jù)一致（表3）。

3 討論

當(dāng)前，基因連鎖和基因表達譜分析等高通量基因組分析方法能有效地對基因進行分類，并產(chǎn)生數(shù)百個候選疾病基因，但不能提供足夠的疾病特異性基因信息，因此，這些方法在疾病基因發(fā)現(xiàn)方面存在較大問題[15]。近年來，生物信息學(xué)方法廣泛應(yīng)用于疾病基因發(fā)現(xiàn)，特別是ToppGene在疾病基因發(fā)現(xiàn)方面具有獨特點。本研究中，我們的興趣在于通過計算生物學(xué)策略“ToppGene”，發(fā)現(xiàn)新的肺腺癌疾病基因。通過本研究，我們篩選到36個候選疾病基因，經(jīng)過文獻分析，發(fā)現(xiàn)21個基因在腫瘤方面的研究幾無報道（Pubmed數(shù)庫范圍內(nèi)）。隨后，我們選取CD36、PMAIP1及FABP4三個基因進行熒光定量PCR驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD36、PMAIP1及FABP4在A549細胞中均下調(diào)表達，與芯片數(shù)據(jù)相一致。

表1 GSE7670和GSE10072中芯片樣本差異表達基因分析結(jié)果Tab 1 Analysis of lung adenocarcinoma differential expression genes against two GEO gene sets GSE10072 and GSE7670

表2 Toppgene篩選新的肺腺癌疾病候選基因（注：選取P＜0.01的基因）Tab 2 The screen of lung adenocarcinoma candidate genes using Toppgene(Note: Genes were selected based on P＜0.01)

表3 CD36、PMAIP1及FABP4的熒光定量PCR實驗結(jié)果Tab 3 Expression of three genes CD36, PMAIP1 and FABP4 using fluorescent quantitation PCR

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，生物信息量也成爆炸式增長，生物醫(yī)學(xué)文獻作為成果展示和學(xué)術(shù)交流的主要方式之一，其數(shù)目之大、增長速度之快遠遠超過了其它學(xué)科領(lǐng)域，例如，Medline收集了全世界4 800多種生物學(xué)及醫(yī)學(xué)雜志上的1 800多萬篇文獻，并且以每個月超過萬篇的速度增長。海量的文獻中蘊涵著豐富的生物學(xué)信息，因此，如何挖掘和發(fā)現(xiàn)其中有生物學(xué)意義的信息具有重要意義。Genecards[10]是一種收載較為全面的基因數(shù)據(jù)平臺，對基因注釋全面而規(guī)范；Fable也是一種功能強大的文獻挖掘工具，特別是在人類疾病基因和蛋白的挖掘方面功能具有獨特優(yōu)勢。為了更全面地確定已知肺腺癌疾病基因， 在本研究中，我們聯(lián)合應(yīng)用Genecards和Fable兩種文獻挖掘工具，建立一個含277個基因的“訓(xùn)練基因集”，并應(yīng)用此“訓(xùn)練基因集”最終篩選到肺腺癌候選疾病基因。

Toppgene[11]是一種基于功能相似性的候選疾病基因篩選工具，Toppgene最大優(yōu)點在于，它可從GO注釋、通路、蛋白相互作用、疾病表型、疾病、轉(zhuǎn)錄因子等14個方面對候選基因進行全面評估，最后依據(jù)總體P值對候選基因進行排序。與其它基于功能相似性的候選基因發(fā)現(xiàn)方法一樣，基于Toppgene的候選疾病基因篩選方面也有一定的缺陷，如：①仍有約1/3的基因沒有作功能注釋；②僅有部分的基因具有通路和表型注釋；③蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)仍不完善，特別是通過實驗驗證的數(shù)據(jù)有限。相信，隨著生物信息學(xué)與各種生物技術(shù)的快速發(fā)展，Toppgene獲得的結(jié)果會越來越完善。

總之，通過本研究，我們篩選到一些可供進一步實驗研究的肺腺癌候選基因，有關(guān)這此候選基因在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用仍需進一步的實驗證實。